玉米光敏色素A1基因(ZmPHYA1)在棉花中的转化及分子鉴定
马燕斌, 王霞, 李换丽, 王平, 张建诚, 文晋, 王新胜, 宋梅芳, 吴霞, 杨建平
作物学报
2021, 47 ( 6):
1197-1202.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2021.03037
为评价玉米ZmPHYA1基因在棉花种质资源改良中的价值, 本研究利用农杆菌介导法在陆地棉(Gossypium hirsutum) R15材料中进行了玉米ZmPHYA1基因的遗传转化。经过愈伤组织诱导、抗性愈伤筛选、体细胞分化诱导后获得棉花转基因再生植株。通过田间草铵膦除草剂筛选鉴定抗性植株, 并利用PCR扩增其草铵膦抗性基因和目的基因ZmPHYA1进行分子鉴定, 发现阳性植株对草铵膦除草剂具较好抗性, 并可扩增到256 bp的草铵膦抗性基因和217 bp ZmPHYA1基因的特异条带。进一步通过免疫印迹检测表明, 3个不同转基因株系中外源ZmPHYA1基因可正常表达约170 kD大小的蛋白, 且在不同组织中该外源蛋白均可正常表达。此外, 对转基因植株的不同农艺性状分析表明, 转基因株系株高明显低于受体对照, 而铃重和纤维长度等性状无明显差异。本研究成功获得具有草铵膦抗性和外源ZmPHYA1基因的棉花新种质材料, 为进一步利用光敏色素基因创新种质资源提供了材料来源。
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图3
不同棉花转基因株系中外源ZmPHYA1蛋白表达的免疫印迹检测 M: 蛋白marker; WT: 转基因棉花受体R15; Isolated non-transgenic line: 转基因株系分离的非抗性株; #9、#14、#41分别为转外源ZmphyA1基因的不同株系Line 9、Line 14和Line 41。“+”为检测中利用转玉米中同源基因ZmPHYA2 (3393 bp)的阳性棉花植株。
正文中引用本图/表的段落
为了检测株系中外源ZmPHYA1蛋白的表达, 我们分别提取受体R15和转基因株系中Line 9、Line 14、Line 41株系幼嫩叶片总蛋白进行分析, 利用ZmPHYA1融合标签蛋白Myc的特异抗体进行免疫印迹杂交, 结果表明, 在转基因株系Line 9、Line 14和Line 41中能够检测到约170 kD左右的条带, 而对照R15和分离出的非抗植株中无目的条带(图3-A)。该结果表明, ZmPHYA1基因在Line 9、Line 14和Line 41株系中能够正常表达。我们同时在不同组织中检测了以上株系中ZmPHYA1的表达。免疫印迹结果表明, 转基因Line 9株系的叶、花和茎中, ZmPHYA1均能正常表达(图3-B)。
光敏色素是与色素蛋白相关的一类蛋白, 在植物中过量表达PHYA基因能够引起多效作用, 如矮化、色素增加和延迟叶片衰老等。在不同作物中过表达PHYA基因证实, 其能够影响植物株高、籽粒产量等性状[13,15-17]。本研究中, 通过DNA水平和蛋白水平检测, 表明ZmPHYA1基因稳定插入棉花中, 可正常翻译成预期蛋白。选取其中1个材料进行不同组织的蛋白表达分析, 该蛋白可以在转基因植株的不同组织部位进行表达, 预示其可能在转基因株系中的不同组织均发挥一定的作用。另外, 预测蛋白大小约为140 kD, 但从图3中可以看到实际蛋白条带约170 kD,大于预期预测, 分析可能是蛋白翻译后修饰等原因导致分子量变大, 所以杂交条带大于预期蛋白。而本研究中转基因植株株高测定表明, 过表达ZmPHYA1能够引起棉花株高的降低, ZmPHYA1引起该表型相关的分子机制需要做进一步研究。
本文的其它图/表
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表1
转基因棉花植株中用于目标基因的检测引物
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图1
外源ZmPHYA1 基因的棉花转化与再生植株的草铵膦抗性基因检测
A: 农杆菌侵染后的愈伤筛选及诱导; B: 愈伤诱导增殖; C: 胚型愈伤分化形成的体细胞胚胎; D: 再生的幼苗; E: 再生的嫁接植株; F: 部分再生株草铵膦抗性基因的检测, 其中1、2、4分别为株系Line 9、Line 14和Line 41, 3为非转基因的再生株, “-”为受体对照, “+”为质粒阳性扩增, M: DNA marker。
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图2
转外源基因ZmPHYA1棉花草铵膦抗性株系的鉴定与PCR分子检测
A, B: 抗除草剂检测的不同阳性植株后代; C: 分离的非抗性植株后代; D: 部分抗性植株的ZmPHYA1 基因的PCR检测, 其中“+”为质粒阳性扩增, 1和2为Line 9株系的不同后代单株, 3和4为Line 14株系的不同后代单株, 5和6为Line 41株系的不同后代单株。“-”为受体对照; M: DNA marker。
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图4
转基因植株不同农艺性状的分析比较
A: 转基因株系的株高表型, 标尺为10 cm; B依次为WT、#9 (Line 9), #14 (Line 14), #41 (Line 41)株系纤维长度图, 标尺为1 cm; C、D、E和F分别为WT、#9 (Line 9)、#14 (Line 14)、#41 (Line 41)的株系平均株高、平均单铃籽棉重、衣分以及纤维长度。*表示P < 0.05差异显著。
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