紫苏二酰基甘油酰基转移酶2基因克隆与功能研究 作物学报    2020, 46 (8): 1283-1290.   DOI: 10.3724/SP.J.1006.2020.94192

图3 不同植物DGAT2蛋白序列比对分析
PfDGAT2: 紫苏; SiDGAT2: 芝麻(XP_011098009.1); StDGAT2: 马铃薯(XP_006365015.1); AtDGAT2: 拟南芥(OAP06431.1); GmDGAT2: 大豆(NP_001299586.1); NtDGAT2: 烟草(AGL46984.1); CsDGAT2: 亚麻荠 Camelina sativa(XP_010426724)。黑色方框内依次为DGAT2蛋白的YFP、EPHS、GGVQE、RXGFX(K/R)XAXXXGXX(L/V)VPXXXFG(E/Q)和VVGRPI的保守结构域。

正文中引用本图/表的段落

为了研究紫苏与拟南芥、烟草、玉米等植物间的亲缘关系, 利用MEGA4.0软件对紫苏Perilla frutescens、芝麻Sesamum indicum (XP_011098009.1)、蓖麻Ricinus com munis (NP_001310616.1)、拟南芥Arabidopsis thaliana (OAP06431.1)、大豆Glycine max (NP_001299586.1)、蒺藜苜蓿Medicago truncatula (XP_003612436.1)、麻疯树Jatropha curcas (NP_001292973.1)、可可Theobroma cacao (EOX90582.1)、亚麻荠Camelina sativa (XP_010426724)、烟草Nicotiana tabacum (AGL46984.1)、甘蓝型油菜Brassica napus (XP_013734399.2)、马铃薯Solanum tuberosum (XP_006365015.1)和玉米Zea mays (AQL03437.1)的DGAT2候选蛋白进行系统树分析表明(图2), 紫苏与油菜、蓖麻、可可等双子叶植物的DGAT2聚为一支, 与单子叶植物玉米亲缘关系最远, 其进化基本符合植物进化分类。其中, 紫苏与芝麻SiDGAT2亲缘关系最近, 其次与烟草、马铃薯蛋白亲缘关系较近; 与蓖麻、可可树等其他物种的DGAT2蛋白在进化上的亲缘关系较远, 推测紫苏PfDGAT2基因的功能可能与芝麻SiDGAT2基因相似。多序列比对分析(图3)发现, PfDGAT2编码的蛋白与其他植物DGAT2蛋白相似, 具有YFP、EPHS、GGVQE、VPVFCFG和VVGRPI五个典型的植物DGAT2酶的保守结构域。

TAG是植物油最重要的储存形式, 随着对TAG合成研究的不断深入, 作为催化TAG合成积累途径中的最后一步, DGAT2的表达模式及功能受到了极大的关注。本研究在紫苏中克隆得到编码329个氨基酸的PfDGAT2基因, PfDGAT2包含2个预测的跨膜结构域, 此外, 它还具有DGAT2的保守结构域(图3), 其中YFP和EPSH是DGAT2蛋白的关键酶活性位点。Stone等[32]在酿酒酵母中突变DGAT2基因发现, YFP是DGAT2的关键保守结构域, Liu等[33]发现, RXGFX(K/R)XAXXXGXX(L/V)VPXXXFG(E/ Q)是DGAT2同源蛋白中都保守的功能元件。与其他植物的DGAT2蛋白质序列比对表明, PfDGAT2蛋白属于DGAT2家族, 此外, 进化分析也支持这一假设, 因为PfDGAT2与其他植物物种的DGAT2蛋白聚在一起(图2)。PfDGAT2蛋白与芝麻SiDGAT2的亲缘关系最近, 其次与烟草、马铃薯DGAT2蛋白亲缘关系较近。前人研究中, 普遍认为DGAT2在营养组织中的表达和活性高于种子, 郑玲等[34]发现, 烟草不同器官中都表达了花生AhDGAT2a基因, 但在柱头和花药中显示出较强表达。He等[35]对蓖麻RcDGAT2基因表达分析表明, DGAT2在种子中的表达量比在营养组织中的更高, 因此还需从不同植物中分离DGAT2基因并研究其表达模式。前人对紫苏PfDGAT2仅研究了不同品种的种子表达模式, 没有做深入的研究, 本试验从紫苏不同组织以及种子不同发育过程2个阶段做了PfDGAT2的表达模式研究, 表明PfDGAT2在10 d种子中表达量最高, 在15 d种子中表现出较高的表达水平(图4), 验证了紫苏中DGAT2基因在种子的表达和活性高于其他组织。由于种子发育中早期是脂肪酸积累的关键时期, 中后期虽然PfDGAT2的表达量逐渐下调, 但TAG已经储存到了油体蛋白中, 所以转PfDGAT2基因拟南芥成熟种子含油率显著升高, 以上结果说明PfDGAT2在种子脂肪酸积累中发挥主导作用。

本文的其它图/表

• 表1 PCR引物
  
• 图1 PfDGAT2基因的克隆与分析
  A: PfDGAT2的PCR扩增产物, M: DL2000 DNA marker。B: PfDGAT2 保守结构域的预测结果。
  
• 图2 不同植物DGAT2氨基酸序列的系统进化树
  分支上的数字表示Bootstrap验证中基于1000次重复该节点的可信度。
  
• 图4 PfDGAT2基因不同组织和种子不同时期的相对表达量
  柱值标以不同字母表示在P < 0.05水平差异显著性。数据点为平均值±标准误(n = 3)。
  
• 图5 转PfDGAT2拟南芥种子含油率
  柱值标以不同字母表示在P < 0.05水平差异显著性。数据点为平均值±标准误(n = 3)。
  
• 图6 转 PfDGAT2 拟南芥种子脂肪酸相对含量分析
  图中*为PD2-1、PD2-3、PD2-5、PD2-5与野生型Col-0之间各组分显著性分析。*代表在P < 0.05时显著性的差异, **代表在P < 0.01时显著性的差异, ***代表在P < 0.001时显著性的差异。数据点为平均值±标准误(n = 3)。