大豆生物钟基因GmLNK1/2、GmRVE4/8和GmTOC1 CRISPR/Cas9组织表达分析及敲除靶点的鉴定
甘卓然,石文茜,黎永力,侯智红,李海洋,程群,董利东,刘宝辉,芦思佳
作物学报
2020, 46 ( 8):
1291-1300.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2020.94169
生物钟基因能够参与调控植物的整个生命进程, 对提高作物产量具有重要的作用。LNK1 (NIGHT LIGHT- INDUCIBLE AND CLOCK-REGULATED 1)、LNK2、RVE4 (REVEILLE 4)、RVE8 (REVEILLE 8)和TOC1 (TIMING OF CAB EXPRESSION 1)是植物中重要的生物钟基因。本研究利用BLAST同源比对和进化树分析的方法分别鉴定AtLNK1、AtLNK2、AtRVE4、AtRVE8和AtTOC1在大豆中的同源基因, 通过qRT-PCR实验证明这些生物钟基因在大豆根、茎、叶等组织中均有表达。成功构建这些基因的CRISPR/Cas9敲除载体, 并利用大豆根毛转化体系成功鉴定出13个基因的CRISPR/CAS9有效靶点。为进一步获得稳定的大豆突变体材料及研究其生物钟基因的功能提供了理论基础。
靶点引物
Target primer | 引物序列
Primer sequence (5°-3°) | 靶点对应基因
Target of gene | | LNK1T1F | gtcaGGAGACAAGTGTGTGGTGG | GmLNK1a, GmLNK1b | | LNK1T1R | aaacCCACCACACACTTGTCTCC | GmLNK1a, GmLNK1b | | LNK1T2F | gtcaAGAGGAGTTCTGCTGGCTC | GmLNK1a, GmLNK1b | | LNK1T2R | aaacGAGCCAGCAGAACTCCTCT | GmLNK1a, GmLNK1b | | LNK1T3F | attgCTTGGGAGACAAGTGTGTGG | GmLNK1c, GmLNK1d | | LNK1T3R | aaacCCACACACTTGTCTCCCAAG | GmLNK1c, GmLNK1d | | LNK1T4F | attgAGACTTTGAAGATGTTGAC | GmLNK1c, GmLNK1d | | LNK1T4R | aaacGTCAACATCTTCAAAGTCT | GmLNK1c, GmLNK1d | | LNK2T1F | gtcaACATAATATGGGGTGAAGG | GmLNK2a, GmLNK2b | | LNK2T1R | aaacCCTTCACCCCATATTATGT | GmLNK2a, GmLNK2b | | LNK2T2F | gtcaAAACTGATCAGGGTTCCCT | GmLNK2c, GmLNK2d | | LNK2T2R | aaacAGGGAACCCTGATCAGTTT | GmLNK2c, GmLNK2d | | LNK2T3F | attgTTTGATTGGAACGACGAAG | GmLNK2a, 2b, 2c, 2d | | LNK2T3R | aaacCTTCGTCGTTCCAATCAAA | GmLNK2a, 2b, 2c, 2d | | LNK2T4F | attgTCATATTGTGCCTTATCCGG | GmLNK2c, GmLNK2d | | LNK2T4R | aaacCCGGATAAGGCACAATATGA | GmLNK2c, GmLNK2d | | RVE48T1F | gtcaCTTCCCTGCTGATGAATGC | GmRVE4/8b, GmRVE4/8c | | RVE48T1R | aaacGCATTCATCAGCAGGGAAG | GmRVE4/8b, GmRVE4/8c | | RVE48T2F | gtcaTCATCCCATGTGACATACCC | GmRVE4/8a, GmRVE4/8d | | RVE48T2R | aaacGGGTATGTCACATGGGATGA | GmRVE4/8a, GmRVE4/8d | | RVE48T3F | attgCAGCTTTGCGCTTTGGACG | GmRVE4/8b, GmRVE4/8c | | RVE48T3R | aaacCGTCCAAAGCGCAAAGCTG | GmRVE4/8b, GmRVE4/8c | | RVE48T4F | attgAAGCTTTGCGCTTAGGCCG | GmRVE4/8a, GmRVE4/8d | | RVE48T4R | aaacCGGCCTAAGCGCAAAGCTT | GmRVE4/8a, GmRVE4/8d | | TOC1T1F | gtcaCGATTCCAAGAGTTCTCAAG | GmTOC1a, GmTOC1b | | TOC1T1R | aaacCTTGAGAACTCTTGGAATCG | GmTOC1a, GmTOC1b | | TOC1T2F | gtcaGTGATGTCCGCACAAGATG | GmTOC1a, GmTOC1b | | TOC1T2R | aaacCATCTTGTGCGGACATCAC | GmTOC1a, GmTOC1b | | TOC1T3F | attgGTGGGAATAATAGTAAGAG | GmTOC1c, GmTOC1d | | TOC1T3R | aaacCTCTTACTATTATTCCCAC | GmTOC1c, GmTOC1d | | TOC1T4F | attgTTGTAAAGTGCTTGAGGCT | GmTOC1c, GmTOC1d | | TOC1T4R | aaacAGCCTCAAGCACTTTACAA | GmTOC1c, GmTOC1d |
View table in article
表1
基因靶点引物列表
正文中引用本图/表的段落
利用CRISPR direct在线网站(http://crispr.dbcls.jp/)进行靶点设计, 载体构建所用基因靶点引物信息, 如表1所示。
利用 DNAMAN软件, 分别与AtLNK1、AtLNK2、AtTOC1、AtRVE4、AtRVE8进行同源性比对。表明, GmLNK1a/b/c/d在第503~618位氨基酸比较保守, 保守率约为63.38% (图1-A)。GmLNK2a/b/c/d在第176~224、438~471和511~620位氨基酸比较保守, 保守率约为68.81% (图1-B)。GmTOC1a/b/c/d在第27~205、553~622位氨基酸比较保守, 保守率约为72.07% (图1-C)。GmRVE4/8a/b/c/d在第35~124、226~282位氨基酸比较保守, 与AtRVE4比对, 保守率约为73.37%, 与AtRVE8比对, 则保守率约为76.66% (图1-D)。
生物钟基因在整个植物生命进程及应答环境胁迫过程中扮演至关重要的角色, 因此检测生物钟基因在植物中的表达部位非常重要。通过qRT-PCR技术检测显示, GmLNK1a、GmLNK1b和GmLNK1c、GmLNK1d在大豆各个组织中均有表达, 但GmLNK1a/b/c表达量较低, 而GmLNK1d在下胚轴、子叶、茎、生长点中表达较高(图2-A); GmLNK2a/b/c/d在大豆各个组织中均有表达, 且在初生叶中表达最高(图2-B); GmTOC1家族中4个GmTOC1的表达情况与GmLNK1家族相似, GmTOC1a、GmTOC1b和GmTOC1c的表达量都很低, GmTOC1d在下胚轴的表达量最高(图2-C); GmRVE4/8家族则没有明显的规律, GmRVE4/8a在三出复叶处的表达量最高, GmRVE4/8b在花处的表达量最高, GmRVE4/8c在生长点处的表达量最高, GmRVE4/8d在花处的表达量最高(图2-D)。
A: GmLNK1a/b/c/d在W82中的组织特异表达; B: GmLNK2a/b/c/d在W82中的组织特异表达; C: GmTOC1a/b/c/d在W82中的组织特异表达; D: GmRVE4/8a/b/c/d在W82中的组织特异表达。
为了鉴定这些基因有效的基因编辑靶点, 分别将GmLNK1a/b/c/d、GmLNK2a/b/c/d、GmTOC1a/b/c/d、GmRVE4/8 a/b/c/d 16个基因的16个靶点构建到4个CRISPR/Cas9载体上, 每个基因包含2~3个靶点, 各基因所对应靶点如表1所示。载体结构如图3所示, GmLNK1、GmLNK2、GmTOC1和GmRVE4/8基因的T1靶点连接拟南芥的AtU3d启动子, T2靶点连接拟南芥的AtU3b启动子, T3靶点连接拟南芥的AtU6-1启动子, T4靶点连接拟南芥的AtU6-29启动子。
本文的其它图/表
|
