大豆生物钟基因GmLNK1/2、GmRVE4/8和GmTOC1 CRISPR/Cas9组织表达分析及敲除靶点的鉴定
甘卓然,石文茜,黎永力,侯智红,李海洋,程群,董利东,刘宝辉,芦思佳
作物学报
2020, 46 ( 8):
1291-1300.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2020.94169
生物钟基因能够参与调控植物的整个生命进程, 对提高作物产量具有重要的作用。LNK1 (NIGHT LIGHT- INDUCIBLE AND CLOCK-REGULATED 1)、LNK2、RVE4 (REVEILLE 4)、RVE8 (REVEILLE 8)和TOC1 (TIMING OF CAB EXPRESSION 1)是植物中重要的生物钟基因。本研究利用BLAST同源比对和进化树分析的方法分别鉴定AtLNK1、AtLNK2、AtRVE4、AtRVE8和AtTOC1在大豆中的同源基因, 通过qRT-PCR实验证明这些生物钟基因在大豆根、茎、叶等组织中均有表达。成功构建这些基因的CRISPR/Cas9敲除载体, 并利用大豆根毛转化体系成功鉴定出13个基因的CRISPR/CAS9有效靶点。为进一步获得稳定的大豆突变体材料及研究其生物钟基因的功能提供了理论基础。
培养基类型
Medium type | 药品名称
Name of the medicine | 药品用量
Medicine
dosage | 萌发培养基
Germination medium | B5盐 B5 salt mixture | 1× | | 蔗糖 Sucrose (g L-1) | 20 | | 琼脂 Agar (g L-1) | 8 | 发根培养基
Rooting medium | MS合成盐 MS salt mixture | 1× | | 蔗糖 Sucrose (g L-1) | 30 | | 2-(4-吗啉)乙磺酸 MES | 0.6 | | 琼脂 Agar (g L-1) | 8 | | 头孢霉素 Cef (mg L-1) | 250 | | 羧苄青霉素 Car (mg L-1) | 250 |
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表2
萌发培养基与根诱导培养基
正文中引用本图/表的段落
参照表2配制萌发及根诱导培养基, 并参照Cheng等[23]方法进行根毛转化。步骤如下: (1)将大豆种子灭菌, 取饱满没有病斑的籽粒置干燥器中, 在干燥器中放一个200 mL烧杯, 盛96 mL次氯酸钠和4 mL浓盐酸, 灭菌12~16 h。(2)根据表2配制大豆萌发培养基, 在无菌操作台中将已灭菌的大豆种子均匀摆放到萌发培养基。(3)大豆种子萌发5 d左右, 根据表2配制发根培养基, 在无菌操作台中利用手术刀在大豆的子叶上面切一个小洞。然后将处理的大豆子叶均匀放置到发根培养基上, 取20 μL含有目的载体的农杆菌K599放到大豆子叶的小洞中。(4)将培养基放在大豆无菌培养室中, 培养15 d左右, 从大豆子叶的侵染部位会有根毛长出, 分别收集大豆的根毛于液氮中速冻。
生物钟基因在整个植物生命进程及应答环境胁迫过程中扮演至关重要的角色, 因此检测生物钟基因在植物中的表达部位非常重要。通过qRT-PCR技术检测显示, GmLNK1a、GmLNK1b和GmLNK1c、GmLNK1d在大豆各个组织中均有表达, 但GmLNK1a/b/c表达量较低, 而GmLNK1d在下胚轴、子叶、茎、生长点中表达较高(图2-A); GmLNK2a/b/c/d在大豆各个组织中均有表达, 且在初生叶中表达最高(图2-B); GmTOC1家族中4个GmTOC1的表达情况与GmLNK1家族相似, GmTOC1a、GmTOC1b和GmTOC1c的表达量都很低, GmTOC1d在下胚轴的表达量最高(图2-C); GmRVE4/8家族则没有明显的规律, GmRVE4/8a在三出复叶处的表达量最高, GmRVE4/8b在花处的表达量最高, GmRVE4/8c在生长点处的表达量最高, GmRVE4/8d在花处的表达量最高(图2-D)。
A: GmLNK1a/b/c/d在W82中的组织特异表达; B: GmLNK2a/b/c/d在W82中的组织特异表达; C: GmTOC1a/b/c/d在W82中的组织特异表达; D: GmRVE4/8a/b/c/d在W82中的组织特异表达。
大豆是古四倍体植物, 约75%的基因重复[37]。在大豆中一个基因往往存在2~4个拷贝, 而且这些基因大多是功能冗余的, 随机突变一个基因往往不会产生表型[38]。随着对CRISPR/Cas9系统的不断完善, 现已成功应用到大豆中, 实现对目标基因的定点编辑[18-19,39]。但由于大豆的转化效率低, 基因组复杂, 生长周期长等特点, CRISPR/ Cas9技术在大豆中的应用仍然会出现靶点无效的问题。生物钟基因在植物的生长发育、生物胁迫和非生物胁迫中都扮演着重要的角色。但大部分生物钟基因在大豆中的功能都没有被解析。本试验通过蛋白序列比对和进化树分析鉴定了大豆中的GmLNK1、GmLNK2、GmTOC1、GmRVE4/8同源基因, 初步分析了它们在大豆植株不同组织中的表达情况, 为进一步预测这些基因在大豆的不同组织中是否具有功能提供了理论基础。例如, GmRVE4/8a在三出复叶中的表达量最高, 推测GmRVE4/8a在大豆的叶片中具有重要功能; GmRVE4/8b和GmRVE4/8d在大豆的花中表达量最高, 这2个基因可能对大豆花的发育具有重要作用; 而GmRVE4/8c在生长点处的表达量最高, GmRVE4/8c可能与大豆的开花和生长习性有关。
本文的其它图/表
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