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大豆生物钟基因GmLNK1/2GmRVE4/8GmTOC1 CRISPR/Cas9组织表达分析及敲除靶点的鉴定
甘卓然,石文茜,黎永力,侯智红,李海洋,程群,董利东,刘宝辉,芦思佳
作物学报    2020, 46 (8): 1291-1300.   DOI: 10.3724/SP.J.1006.2020.94169
摘要   (669 HTML14 PDF(pc) (2939KB)(489)  

生物钟基因能够参与调控植物的整个生命进程, 对提高作物产量具有重要的作用。LNK1 (NIGHT LIGHT- INDUCIBLE AND CLOCK-REGULATED 1)、LNK2、RVE4 (REVEILLE 4)、RVE8 (REVEILLE 8)和TOC1 (TIMING OF CAB EXPRESSION 1)是植物中重要的生物钟基因。本研究利用BLAST同源比对和进化树分析的方法分别鉴定AtLNK1AtLNK2AtRVE4AtRVE8AtTOC1在大豆中的同源基因, 通过qRT-PCR实验证明这些生物钟基因在大豆根、茎、叶等组织中均有表达。成功构建这些基因的CRISPR/Cas9敲除载体, 并利用大豆根毛转化体系成功鉴定出13个基因的CRISPR/CAS9有效靶点。为进一步获得稳定的大豆突变体材料及研究其生物钟基因的功能提供了理论基础。



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图3 Cas9载体结构图
a: 靶点LNK1T1、LNK2T1、TOC1T1和RVE4/8T1; b: 靶点LNK1T2、LNK2T2、TOC1T2和RVE4/8T2; c: 靶点LNK1T3、LNK2T3、TOC1T3和RVE4/8T3; d: 靶点LNK1T4、LNK2T4、TOC1T4和RVE4/8T4。
正文中引用本图/表的段落
为了鉴定这些基因有效的基因编辑靶点, 分别将GmLNK1a/b/c/dGmLNK2a/b/c/dGmTOC1a/b/c/dGmRVE4/8 a/b/c/d 16个基因的16个靶点构建到4个CRISPR/Cas9载体上, 每个基因包含2~3个靶点, 各基因所对应靶点如表1所示。载体结构如图3所示, GmLNK1GmLNK2GmTOC1GmRVE4/8基因的T1靶点连接拟南芥的AtU3d启动子, T2靶点连接拟南芥的AtU3b启动子, T3靶点连接拟南芥的AtU6-1启动子, T4靶点连接拟南芥的AtU6-29启动子。
本文的其它图/表