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大豆生物钟基因GmLNK1/2GmRVE4/8GmTOC1 CRISPR/Cas9组织表达分析及敲除靶点的鉴定
甘卓然,石文茜,黎永力,侯智红,李海洋,程群,董利东,刘宝辉,芦思佳
作物学报    2020, 46 (8): 1291-1300.   DOI: 10.3724/SP.J.1006.2020.94169
摘要   (675 HTML14 PDF(pc) (2939KB)(520)  

生物钟基因能够参与调控植物的整个生命进程, 对提高作物产量具有重要的作用。LNK1 (NIGHT LIGHT- INDUCIBLE AND CLOCK-REGULATED 1)、LNK2、RVE4 (REVEILLE 4)、RVE8 (REVEILLE 8)和TOC1 (TIMING OF CAB EXPRESSION 1)是植物中重要的生物钟基因。本研究利用BLAST同源比对和进化树分析的方法分别鉴定AtLNK1AtLNK2AtRVE4AtRVE8AtTOC1在大豆中的同源基因, 通过qRT-PCR实验证明这些生物钟基因在大豆根、茎、叶等组织中均有表达。成功构建这些基因的CRISPR/Cas9敲除载体, 并利用大豆根毛转化体系成功鉴定出13个基因的CRISPR/CAS9有效靶点。为进一步获得稳定的大豆突变体材料及研究其生物钟基因的功能提供了理论基础。



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图4 发生编辑靶点的测序峰图
A: GmLNK1a的靶点LNK1T1、GmLNK1b的靶点LNK1T2、GmLNK1c的靶点LNK1T4和GmLNK1d的靶点LNK1T4突变情况; B: GmLNK2a的靶点LNK2T1、GmLNK2b的靶点LNK2T1、GmLNK2c的靶点LNK2T4和GmLNK2d的靶点LNK2T4突变情况; C: GmTOC1b的靶点TOC1T2、GmTOC1c的靶点TOC1T4和GmTOC1d的靶点TOC1T4突变情况; D: GmRVE4/8b的靶点RVE4/8T1和GmRVE4/8d的靶点RVE4/8T4突变情况。
正文中引用本图/表的段落
从图4-A可以看出, GmLNK1基因的T1靶点测序峰图在靶点附近发生套峰, 说明这个靶点是有效的。根据测序发现的16个基因中, 有13个被成功编辑, GmLNK1a的LNK1T1靶点、GmLNK1b的LNK1T2靶点、GmLNK1cGmLNK1d的LNK1T4靶点可被有效编辑(图4-A); GmLNK2aGmLNK2b的靶点LNK2T1靶点, GmLNK2cGmLNK2d的LNK2T4可被有效编辑(图4-B), GmRVE4/8b的RVE48T1靶点和GmRVE4/8d的RVE48T4靶点可被有效编辑(图4-C), GmTOC1b的TOC1T2靶点, 以及GmTOC1cGmTOC1d的TOC1T4可被有效编辑(图4-D)。
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