10079为来自于粳稻品种日本晴( Oryza sativa L. subsp. japonica, cv. Nipponbare)的一个迟熟突变品系, 由中国科学院遗传与发育生物学研究所储成才研究员和方军博士提供。用化学诱变剂EMS处理10079, 获得一份黄绿叶突变体 ygl80, 经过多代自交, 突变体表型稳定遗传。将 ygl80分别与野生型亲本10079和籼稻品种浙辐802杂交, 在四川成都分别播种亲本、F₁和F₂, 从苗期开始观察叶色表现。成熟期调查突变体 ygl80和野生型亲本10079的株高、有效穗、穗长、每穗着粒数、结实率、千粒重等主要农艺性状, 每个样本3次重复(小区), 调查样本数15株。

参照Lichtenthaler^{[ 15]}的方法, 在大田苗期和孕穗期, 分别取 ygl80突变体及其野生型亲本的上部叶片, 每个材料重复3次, 每个重复从同样的5个植株上混合取0.2 g叶片, 剪碎浸泡在15 mL的80%丙酮溶液中, 于4℃避光浸提48 h, 中间震荡数次, 最后定容至25 mL。用紫外分光光度计(UV-1700)测定提取液在663、646和470 nm波长下的吸光值。叶绿素a含量(mg g^-1) = (12.21A₆₆₃ - 2.81A₆₄₆) V / 1000 W, 叶绿素b含量(mg g^-1) = (20.13A₆₄₆ - 5.03A₆₆₃) V/ 1000 W, 类胡萝卜素含量(mg g^-1) = (1000A₄₇₀ - 3.27C_a - 104C_b) V / (229 × 1000 W), 式中, V为叶绿素提取液总体积(mL), W为叶片鲜重(g), C_a = 12.21A₆₆₃ - 2.81A₆₄₆, C_b = 20.13A₆₄₆ - 5.03A₆₆₃。

根据叶色调查与分析结果, 从 ygl80与浙辐802杂交所得F₂群体中, 选取20株正常绿苗和627株黄苗构建成定位群体, 分单株提取总DNA。从F₂植株中随机选取10株正常单株和10株突变单株剪取等量叶片, 将正常绿苗和黄绿苗单株叶片分别混合, 构建正常基因池和突变基因池。用McCouch等^{[ 16]}的方法提取水稻叶片中的DNA。

参照http://www.gramene.org/microsat的SSR引物标记, 并运用Primer5.0软件自行设计插入缺失

(InDel)标记。SSR和InDel引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。参照Panaud等^{[ 17]}的PCR反应体系, 扩增产物经3.0%~4.0%琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色后, 用凝胶扫描成像系统记录电泳分离结果。用MapMaker3.0软件进行遗传作图, 用Kosambi函数将重组率转化为遗传距离(cM), 构建目标基因所在区域的分子标记连锁图谱。

利用水稻基因组注释数据库数据(http://rice. plantbiology.msu.edu/), 根据 ygl80突变体的突变性状, 以及分子标记与目标基因的遗传距离和物理距离, 在突变基因精细定位的染色体区段上遴选 ygl80突变体的候选基因。设计预测基因的引物序列, 分别对野生型和突变体基因组中预测基因序列进行扩增、测序和序列比对, 最终确定突变位点和候选基因。

ygl80突变体生育期均为黄绿色, 明显区别于其野生型亲本10079 (图1)。在成熟期, 与其野生型亲

图1

Fig. 1

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	图1 突变体 ygl80(右)与其野生型亲本10079(左)在苗期(A)及拔节期(B)植株形态Fig. 1 Plant phenotype of ygl80(right) and its wild-type parent 10079 (left) at the seedling (A) and elongation (B) stages

本相比, ygl80突变体的株高、每株有效穗数、每穗着粒数、穗长和千粒重分别减少14.8%、16.5%、21.3%、9.1%和7.4%, 其他农艺性状差异不显著(表1)。

ygl80在苗期和孕穗期的叶绿素a含量分别为0.89 mg g^-1和0.81 mg g^-1, 分别比野生型亲本降低72.36%和49.69%; 叶绿素b含量分别为0.07 mg g^-1和0.13 mg g^-1, 分别降低92.13%和71.74%; 类胡萝卜素含量分别为0.42 mg g^-1和0.30 mg g^-1, 分别降低53.85%和41.18% (表2), 表明 ygl80的突变性状主要由光合色素含量下降引起。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 突变体 ygl80与其野生型亲本10079主要农艺性状的比较 Table 1 Comparison of major agronomic traits between the ygl80 mutant and its wild-type parent 10079 性状 Trait 10079 (CK) ygl80 比对照增减 Compared to CK (%) 抽穗期Days to heading (d) 119.0±0.6 121.0±1.0 1.7 株高Plant height (cm) 101.9±0.5 86.8±1.6 -14.8* 每株有效穗数Number of productive panicles per plant 11.5±0.5 9.6±0.6 -16.5* 穗长Panicle length (cm) 19.7±0.5 17.9±0.2 -9.1* 每穗着粒数Number of spikelets per panicle 111.5±5.9 87.8±5.6 -21.3* 结实率Seed setting rate (%) 91.9±1.9 89.0±1.3 -2.9 千粒重1000-grain weight (g) 24.3±0.5 22.5±0.1 -7.4* *在0.05水平上差异显著。*Significantly different at 0.05 probability level.

表1 突变体 ygl80与其野生型亲本10079主要农艺性状的比较 Table 1 Comparison of major agronomic traits between the ygl80 mutant and its wild-type parent 10079

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 苗期和孕穗期 ygl80突变体与其野生型亲本10079叶片光合色素含量的比较 Table 2 Comparison of photosynthetic pigment contents between the ygl80 mutant and its wild-type parent 10079 during seedling and booting stages 生育期 Growth stage 材料 Material 叶绿素 Chl (mg g-1) 叶绿素a Chl a (mg g-1) 叶绿素b Chl b (mg g-1) 叶绿素a/b Chl a/b β-胡萝卜素 β-Car (mg g-1) 苗期 Seedling stage 10079 (CK) 4.11±0.02 3.22±0.02 0.89±0.00 3.62±0.02 0.91±0.01 ygl80 0.96±0.00 0.89±0.00 0.07±0.00 12.71±0.18 0.42±0.00 比对照增减Compared to CK -76.64%** -72.36%** -92.13%** 9.09** -53.85 %** 孕穗期 Booting stage 10079 2.07±0.04 1.61±0.05 0.46±0.01 3.50±0.16 0.51±0.03 ygl80 0.94±0.04 0.81±0.03 0.13±0.01 6.23±0.83 0.30±0.02 比对照增减Compared to CK -54.59%** -49.69%** -71.74 %** 2.73** -41.18%** *在0.05水平上差异显著。*Significantly different at 0.05 probability level.

表2 苗期和孕穗期 ygl80突变体与其野生型亲本10079叶片光合色素含量的比较 Table 2 Comparison of photosynthetic pigment contents between the ygl80 mutant and its wild-type parent 10079 during seedling and booting stages

将 ygl80分别与野生亲本10079和籼稻品种浙辐802杂交, F₁植株均表现为正常绿叶, F₂代群体中正常绿苗与黄绿苗分离明显, 分离比例经卡方(χ²)测验符合3∶1 (表3), 表明 ygl80的突变性状由1对隐性核基因控制。

以 ygl80与浙辐802杂交F₂群体为定位群体, 用350对较均匀分布于水稻12条染色体上的SSR引物对亲本浙辐802和 ygl80的DNA片段进行扩增, 然后用在两亲本间表现出多态的引物扩增正常绿苗和黄绿苗植株近等基因池, 再用在池中检测到多态的引物分别扩增F₂植株。结果发现, 位于水稻第5染色体长臂的SSR标记RM5140和RM430与目标基因存在连锁关系, 遗传距离分别为8.4 cM和11.9 cM (图2-A)。为了进一步定位目标基因, 根据粳稻日本晴和籼稻9311序列差异进一步设计多对InDel标记(表4), 最终将 ygl80定位在InDel标记C2和C3之间, 遗传距离分别为0.24 cM和0.39 cM (图2-B), 物理距离约为90 kb (图2-C)。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 突变体 ygl80与正常绿色品系杂交F2的叶色分离 Table 3 Segregation of leaf color in F2 population from the crosses between ygl80mutant and green leaf varieties 杂交组合 Cross-combination 总株数 Total number of plants 绿叶植株数 Number of green leaf plants 黄绿叶植株数 No. of yellow-green leaf plants 期望比 Expected ratio χ2 P ygl80/10079 478 351 127 3:1 0.547 0.25-0.50 ygl80/Zhefu802 2606 1979 627 3:1 1.179 0.25-0.50

表3 突变体 ygl80与正常绿色品系杂交F2的叶色分离 Table 3 Segregation of leaf color in F2 population from the crosses between ygl80mutant and green leaf varieties

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 本研究开发的多态性InDel标记 Table 4 Developed polymorphic InDel markers in this study 标记 Marker 正向引物 Forward primer (5′-3′) 反向引物 Reverse primer (5′-3′) 所在BAC Originated BAC C1 GTATCGTCATGCGTCAAC AGAGGCAGGAACCAACCC AC104706 C2 GCGGTTGAAGGCGTCGTA AGGGTGCTGAGTCACAATAGGT AC144742 C3 CCCAATGTCTGGTTCTTT CTCTGGCTTCTCCTTCTG AC136221 C4 TTTGGTGGGTAGGTGGTG AATAGAGGGTTCGGCATC AC136221

表4 本研究开发的多态性InDel标记 Table 4 Developed polymorphic InDel markers in this study

在上述90 kb的定位区域内共有11个预测基因, 其中包括编码叶绿素合酶的 YGL1 ( LOC_Os05g28200)基因(表5)。根据InDel标记C2和C3与 ygl80突变基因的遗传距离(图2-B), 从 ygl80突变体及其野生型亲本10079中扩增出 YGL1基因。DNA测序结果显示, ygl80突变体在 YGL1基因编码区第5027碱基处(位于第14外显子), 碱基C突变为碱基T (图2-D), 使编码蛋白的氨基酸序列第348位的脯氨酸(Pro)突变成亮氨酸(Leu), 推测该基因是造成 ygl80黄绿叶突变性状的候选基因。