试验于2012年在重庆市油菜工程技术研究中心进行。甘蓝型油菜中油821DH系(对照)和转基因821DH植株的2个株系(ov1, ov2)均由重庆市油菜工程技术研究中心提供。于温室种植并按常规栽培管理材料。核盘菌由重庆市油菜工程技术研究中心分离、保存。参照万华方等^{[ 6]}的方法培养、活化以及接种核盘菌。

供试材料长至12片真叶时, 取倒数第3片叶放入保鲜盒迅速带回实验室, 参照Mei等^{[ 7]}的方法, 将菌丝块菌面贴于叶面主叶脉两侧, 保持接种环境内温度23℃, 相对湿度90%。接种36 h后, 测量病斑的长径和短径。根据公式 S = π × a × b/4计算病斑面积, 其中a、b分别为病斑长径(cm)和短径(cm)。每个处理设置3次重复。

接种0、6和12 h后分别用无菌打孔器(内径1.1 cm)沿菌丝块周围在叶片打孔取样, 接种24 h和36 h后的叶片去掉病斑后, 再用无菌打孔器沿病斑周围在叶片打孔。称量后放入研钵加入0.5 mol L^-1的盐酸3 mL, 研磨至匀浆, 转入试管, 超声波处理15 min, 加入3 mL去离子水静置过夜, 14 000 × g离心20 min, 将上清液转入离心管。采用高效液相色谱法(HPLC)^{[ 8]}测定草酸含量, 重复3次。

在VenusilASBC18 (4.6 mm × 250.0 mm, 5 µm)上, 选用0.04 mol L^-1的KH₂PO₄-H₃PO₄缓冲液(pH 2.4)采用Waters2998二极管数组紫外检测器于214 nm检测, 不连续梯度洗脱, 柱温35℃, 进样量20 µL, 检测时间20 min。

接种核盘菌0、6、12、24和36 h后去除病斑, 取其周围约100 mg叶片, 于液氮中迅速研磨成粉末, 并用试剂盒RNAprep pure Plant Kit (天根生化科技(北京)有限公司)提取总RNA, 用RNase-free DNase I (Fermentas公司)去除DNA杂质。用Thermo NanoDrop 2000c微量紫外分光光度计测定RNA浓度, 1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性。

用cDNA反转录试剂盒(iScript cDNA Synthesis Kit, Bio-Rad), 按照说明书合成总cDNA第1链。以20 μL反应体系[5×iScript Reaction Mix 4 μL、iScript Reverse Transcriptase 1 μL、RNA模板(1 μg总RNA) 11 μL、Nuclease-free water 4 μL]进行反转录, 反应程序为25℃ 5 min, 42℃ 30 min, 85℃ 5 min, 4℃ 10 min。将获得的cDNA稀释50倍, -20℃保存用于qRT-PCR分析。

参照NCBI数据库中相关基因的编码序列, 用软件Geneious 4.85设计引物。所用的引物及内参基因 Actin7和 UBC21的序列见表1。用qRT-PCR试剂盒(SsoAdvantanced SYBRT Green Supermix kit, Bio-Rad)于Bio-Rad CFX96 Real-time System上进行实时荧光定量PCR分析, 10 μL反应体系(SsoAdvantanced SYBRT Green Supermix 5 μL、RNase/DNase-free water 2 μL、上下游引物各0.25 μL, cDNA 2.5 μL)。扩增反应程序为95℃ 30 s, 95℃ 5 s, 61℃ 30 s, 65℃ 5 s, 40个循环(根据不同引物调整退火温度)。每个取样点设3次技术重复, 采用2^-ΔΔCT法分析确定基因的相对表达量。

采用Microsoft Excel 2003作图, SPSS13.0软件进行方差分析。

采用叶片离体接种进行菌核病抗性鉴定, 接种36 h后, 转基因植株和对照都有可见菌斑, 其大小明显不同, 对照的菌斑为深褐色且有穿透叶片的迹象, 而转基因植株的菌斑为白色且没有穿透叶片的迹象(图1)。统计病斑大小由(图2)可见, 转基因油菜离体叶片病斑显著小于对照。叶片菌核病抗性鉴定方差分析结果表明, 转基因植株和对照对菌核病的抗性存在极显著差异( P<0.01)。说明转基因油菜的抗菌核病能力显著提高, BnMAPK1在提高油菜抗菌核病性中起作用。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 qRT-PCR所用引物 Table 1 Primers for qRT-PCR 基因名 Gene name 参考序列登录号 Accession number of reference sequence 正向引物序列 Forward primer (5′-3′) 反向引物序列 Reverse primer (5′-3′) OXO AY884024 TCCTCGACGGCTCTATCACC GTCTTGACTGTAGCAGGCGG Cu/ZnSOD AY970822.1 GGTTGCATGTCTACCGGTCC TGGACAACAACAGCCCTTCC PR2 DQ359126.1 ATCTCCGAAAAGGCCAGGGA TACCATTTACCGCATCGCCC PR3 M95835 ACAGCACCAGACGGACCATA CGTTGGAGACAAGGTCAGGG Acin7 EV116054 CTGGAATTGCTGACCGTATGAG ATCTGTTGGAAAGTGCTGAGGG UBC21 EV086936 CCTCTGCAGCCTCCTCAAGT CATATCTCCCCTGTCTTGAAATGC

表1 qRT-PCR所用引物 Table 1 Primers for qRT-PCR

图1

Fig. 1

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	图1 离体叶片接种36 h后呈现的病斑大小Fig. 1 Difference of lesion on the detached leaves after inoculation with S. sclerotiorum for 36 hours

图2

Fig. 2

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	图2 离体叶片接种核盘菌36 h后病斑的差异比较标有不同字母的材料间差异极显著( P< 0.01)。Fig. 2 Comparison of lesion on the detached leaves after inoculation with S. sclerotiorum for 36 hoursBars superscripted by different letters are significantly different among the lines at P< 0.01.

由图3可见, 转基因植株病斑周围叶片组织的草酸含量在接种前显著低于对照植株, 接种6 h后两者均出现升高现象, 但是, 转基因植株草酸含量升高的幅度显著低于对照植株。24 h转基因植株叶片的草酸含量已恢复到正常水平, 而对照植株叶片草酸含量在36 h才恢复至本底水平。说明转基因植株能更快地降低染病叶片内草酸的积累量, 暗示 BnMAPK1可能通过抑制油菜罹病组织内草酸的积累量, 减少草酸对植株的伤害, 进而提高油菜的抗病性。

2.3 BnMAPK1超量表达对油菜抗病关键酶编码基因表达的影响

2.3.1 OXO的相对表达量动态变化 如图4-a、表2所示, 草酸氧化酶编码基因 OXO的相对表达量在转基因植株和对照间及其与接种时间的互作效应均达到极显著水平( P< 0.01)。接种前(0 h), 转基因植株中 OXO的相对表

图3

Fig. 3

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	图3 离体叶片接种核盘菌后病斑周围叶片草酸含量的比较Fig. 3 Comparison of oxalic acid content around the lesion on the detached leaves inoculated by S. sclerotiorum

达量略低于对照植株。接种后, 转基因植株和对照中的 OXO的相对表达量均逐渐降低, 但转基因植株降低的幅度小于对照植株, 且显著高于对照的表达量。到接种 36 h后, 该基因的相对表达量在转基因植株中又显著上调, 而对照中仍表现为下降趋势。此时转基因植株 OXO表达量是对照植株的30倍 。表明, 核盘菌可能对 OXO的转录有抑制作用, 而 BnMAPK1可降低或部分解除其抑制作用。说明 BnMAPK1基因可能通过介导抗病基因 OXO的表达来改进油菜的抗病性。

2.3.2 Cu/Zn-SOD的相对表达量动态变化 对超氧化物歧化酶编码基因( Cu/Zn-SOD)相对表达量动态变化及方差分析(表2)显示, 转基因植株和对照间及其与接种时间的互作效应均达极显著水平( P< 0.01)。如图4-b所示, 接种前, 转基因植株中 Cu/Zn-SOD的相对表达量略高于对照。接种6 h, 转基因植株和对照的 Cu/Zn-SOD相对表达量均下降, 接种12 h后, 又表现上升趋势且转基因植株上升速度较快, 到接种36 h后转基因植株该基因表达量已高于对照6倍。表明 BnMAPK1基因可诱导抗病相关基因 Cu/Zn- SOD的上调表达, 从而提高油菜的抗病性。

2.3.3 PR3相对表达量动态变化 如图4-c所示, 接种前, 转基因植株和对照中的几丁质酶编码基因 PR3的相对表达水平都很低。随接种时间的延长, 转基因植株和对照中 PR3的相对表达水平逐渐上升, 接种36 h后达最高值, 此时转基因植株的表达量极显著高于对照( P<0.01) (表2)。可见, 核盘菌可诱导 PR3表达, 且在转基因植株中表现更突出, 表明 BnMAPK1基因介导了抗病相关基因 PR3的诱导表达。

2.3.4 PR2相对表达量动态变化 如图4-d所示, 接种核盘菌前(0 h), 转基因植株和对照植株中β-1,3-葡聚糖酶编码基因 PR2的相对表达量甚微。接种后均有不同程度的小幅增加, 36 h后转基因植株中 PR2的相对表达量急剧上升, 且远远大于对照植株中该基因的表达量。方差分析结果表明, 转基因植株和对照间 PR2的相对表达差异达到极显著水平, 转基因植株和对照与接种时间的互作效应也达到极显著水平( P<0.01) (表2)。说明 BnMAPK1可介导抗真菌蛋白β-1,3-葡聚糖编码的基因 PR2的上调表达。

综上所述, 在核盘菌胁迫下 BnMAPK1基因介导抗病相关基因 Cu/Zn-SOD、PR2和 PR3的表达水平显著上调, 同时, 可能可以解除抑制或诱导 OXO的转录表达, 从而提高了油菜的抗病性。

图4

Fig. 4

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	图4 接种菌核病菌的叶片中酶编码基因 OXO(a)、 Cu/Zn-SOD(b)、 PR3 (c)和 PR2(d)的相对表达标有不同字母的材料间差异极显著( P< 0.01)。Fig. 4 Relative expression of OXO(a), Cu/Zn-SOD(b), PR3(c), and PR2(d) in leaves inoculated by S. sclerotiorumBars superscripted by different letters are significantly different among the lines at P< 0.01.

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 酶编码基因相对表达量动态变化方差分析 Table 2 Dynamics analysis of relative expression of the genes encoding four enzymes in the leaf inoculated by S. sclerotiorum 来源 Source 自由度 df F值 F-value OXO Cu/Zn-SOD PR2 PR3 材料 Material 2 10.042** 1224.750** 2707.901** 787.454** 时间 Time 4 469.507** 4447.958** 11453.726** 35573.894** 材料×时间 Material × time 8 13.002** 878.185** 7979.590** 594.885**

表2 酶编码基因相对表达量动态变化方差分析 Table 2 Dynamics analysis of relative expression of the genes encoding four enzymes in the leaf inoculated by S. sclerotiorum

^**表示在 P < 0.01水平差异极显著。^**Significant difference at P < 0.01.