本研究构建的自然群体由154份不同年代育成的普通小麦品种(系)组成。利用83对SSR标记对其进行群体遗传结构分析, 将154份材料分为4个亚群^[21]。从各亚群中挑选典型的多样性材料23份, 与5份粗山羊草(Aegilops tauschii, DD)材料组成多样性代表群体, 用于直接测序, 检测目标基因的序列多态性。此外, 还利用了1份乌拉尔图小麦(Triticum urartu, AA)、1份拟斯卑尔脱山羊草(Aegilops speltoides, SS)和1份四倍体小麦(Triticum polonicum, AABB)材料。所有试验材料均由中国农业科学院作物科学研究所提供。

用Primer Premier 5软件, 参照NCBI公布的6-SFT序列(FJ228688), 设计通用引物F1/R1 (F1: 5′ -TACC AAACTCTCTTAGAGTTCACGAGGG-3′ ; R1: 5′ -CA CGAGTCCACTCTCCCAAACAACAATA-3′ )。根据6-SFT在A、B、D基因组的序列差异, 设计6-SFT-D特异引物F2/R2 (F2: 5′ -TACCAAACTCTCTTAGAGT TCACGAGGG-3′ ; R2: 5′ -CCAAACTATATCGATCCT ACA-3′ )。扩增产物在2850 bp位点存在一个核苷酸变异(T→ C), 据此开发等位变异特异PCR (allele-specific PCR, AS-PCR)引物F3/R3 (F3: 5'-CATACCAGCTTCT GCCAAGGT-3′ ; R3: 5′ -CCAAACTATATCGATCCTAC A-3′ )。为避免假阴性, 设计了在所有材料均能扩增出目标产物的引物F4/R4 (F4: 5′ -GCGCACAACCAGCT CTCC-3′ ; R4: 5′ -GCAGACCACACCGGTTCAC-3′ )。另外, 还设计了4条叠套测序引物SeqF1 (5′ -GTGCAGA TCCCAACGG-3′ )、SeqF2 (5′ -GTCACCTACCGCTCG C-3′ )、SeqF3 (5′ -TCAAGGAGAGCAGCGAC-3′ )和SeqR1 (5′ -AACTCATCGTGGCAGAAG-3′ )。

以供试材料基因组DNA为模板, PCR体系总体积为15 μ L, 含2.1 μ L DNA模板(20 ng μ L^-1)、3.0 μ L 5× buffer、引物各0.3 μ L (10 μ mol L^-1)、0.1 μ L dNTP (10 μ mol L^-1)、0.3 μ LTransStart FastPfu (5 U)和8.9 μ L ddH₂O。PCR程序为95℃ 5 min; 95℃ 1 min, 59℃ 45 s, 72℃ 3.5 min, 32次循环; 72℃ 10 min, 15℃保存。在1.2%琼脂糖凝胶中检测扩增产物, 回收目标片段, 利用6条叠套引物(F2、R2、SeqF1、SeqF2、SeqF3和SeqR1)在ABI 3730XL基因分析仪(Applied Biosystems, 美国)上直接测序, 3次重复。

用DNAStar软件分析6-SFT-D序列的SNP, 利用DnaSP5.10软件分析6-SFT-D基因多态性位点及单倍型, 并计算遗传多态性指数π 值。

2007— 2010年, 种植154份小麦材料于中国农业科学院作物科学研究所昌平试验基地, 设雨养和灌溉两种处理。每小区4行, 行长2.0 m, 行距0.3 m, 每行点播40粒种子。小麦收获时, 从每份材料随机取5株调查千粒重和穗长。

2010年小麦籽粒灌浆至成熟期间, 分6次取穗样, 每份材料随机取5株。前5次在灌浆期内, 取样日依次是5月20日、5月26日、6月2日、6月7日和6月11日, 样品烘干脱粒后称重, 计算千粒重; 最后一次取样在6月中旬(收获期), 其中雨养条件下为6月14日, 灌溉条件下为6月18日, 考种后计算千粒重。

利用AS-PCR标记检测自然群体材料的6-SFT-D基因单倍型。以个体Q值作为协变量, 用TASSEL软件^[22]进行群体结构分析, 将6-SFT-D的单倍型和表型性状数据进行关联分析。用SPSS13统计软件计算不同单倍型的农艺性状值。

利用6-SFT全长引物F1/R1在4份不同倍性材料中扩增到基因的全长DNA序列, 二倍体野生近缘种和六倍体小麦序列比对结果如图1。在六倍体小麦中分离到3种6-SFT序列, 其中AABBDD-3序列与粗山羊草(DD)的序列相似度达到99%, 因此推测AABBDD-3序列来自于六倍体小麦的D基因组, 命名为6-SFT-D。利用6-SFT-D基因组特异引物F2/R2获得6-SFT-D序列(图1)。引物F2/R2在4份二倍体小麦、1份四倍体小麦和5份六倍体小麦中的扩增结果证实, 6-SFT-D序列位于D基因组(图2)。

图1

Fig. 1

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	图1 六倍体小麦(旱选10号)及其近缘种6-SFT的序列比对Fig. 1 Sequence alignment of 6-SFT in hexaploid wheat (cv. Hanxuan 10) and its wild relative species

图2

Fig. 2

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	图2 6-SFT-D基因组定位Fig. 2 Genome locations of 6-SFT-D

利用F2/R2扩增出的目标片段长度为3362 bp, 包括4个外显子、3个内含子及5′ 和3′ -UTR (图3)。外显子区域依次位于30~323、464~472、1126~1986和2487~3188 bp, 第2外显子与6-SFT-A1、6-SFT-A2序列^{[19, 20]}相同, 均为5′ -ATCCCAACG-3′ ; 3个内含子分别位于324~463、473~1125和1987~2486 bp区段; 此外, 1~29 bp为5′ -UTR, 3189~3362 bp为3′ -UTR。

图3

Fig. 3

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图3 小麦6-SFT-D的结构及其4个SNP位点Fig. 3 Schematic representation and four SNP in 6-SFT-D gene sequence

对23份六倍体小麦材料(AABBDD)与5份粗山羊草(DD)组成的多样性代表群体进行6-SFT-D全长测序, 分析其序列多态性。在扩增片段为3362 bp的6-SFT-D序列中共检测到4个多态性位点, 均为SNP位点, 没有InDel (图3), 其中3个SNP位于非编码区, 1个位于编码区, 平均每841 bp有一个SNP位点。这4个SNP位点包括3个转换(A↔ G、C↔ T)和1个颠换(A↔ C), 转换是主要碱基突变类型。与4A染色体上的6-SFT-A1和6-SFT-A2^{[19, 20]}相比, 6-SFT-D的变异频率(1SNP/841 bp)显著小于6-SFT-A1(1SNP/234 bp)和6-SFT-A2(1SNP/242 bp), 进一步证明小麦的D基因组比较保守。6-SFT-D在二倍体小麦中的变异频率(1SNP/841 bp)大于在六倍体小麦(1SNP/3362 bp)中, 可能是六倍体小麦长期经受人工选择的缘故。

在28份材料中, 6-SFT-D的序列多样性呈现不均匀分布, 共检测出的4个SNP位点中, 其中3个位于内含子, 分别位于内含子2和3 (图4)。在外显子4检测到1个SNP, 并且属于同义突变。在6-SFT-D基因序列外显子1、2、3和内含子1中没有发现SNP。6-SFT-D基因全长的π 值为0.0004, 其π 值显著小于6-SFT-A1和6-SFT-A2基因的π 值0.00273和0.00218。

图4

Fig. 4

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	图4 6-SFT-D基因多态性位点分布的Sliding-window分析Fig. 4 Sliding-window analysis of 6-SFT-D polymorphic sites

在28份材料中, 6-SFT-D序列聚类为3种单倍型, 分别是HapI、HapII和HapIII (图5), 分别对应SNP组合C/A/G/C、C/A/G/T和A/G/A/C (表1)。Hap II与Hap I之间有1个SNP位点存在差异, HapIII与HapI之间有3个SNP位点存在差异, HapII和HapIII之间有4个SNP位点存在差异。

图5

Fig. 5

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	图5 6-SFT-D序列单倍型关系树状图Fig. 5 Phylogenetic tree for 6-SFT-Dhaplotypes

23份六倍体小麦材料中, 仅Opata为HapIII基因型, 与5份二倍体材料聚在一类, 其他22份分为两种单倍型(图5)。其中, HapI基因型17份, 包括偃展1号、豫麦18、小齐麦、PANDAS、鲁麦14、晋麦47、旱选10号、大荔1号、春04 9th-5-1、中国春、长武131、长6878、北京8686、北京10号、白齐麦、白糙麦和安85中124-1; HapII基因型5份, 包括红和尚、W7984、沧州小麦、昌乐5号和霸王鞭。由于HapIII基因型六倍体小麦仅有1份, 因此本文仅分析HapI和HapII与农艺性状的关联情况。

为了区分6-SFT-D基因HapI与HapII, 根据2850 bp位点T/C变异设计AS-PCR引物F3/R3 (图6-A)。等位特异引物的正向引物F3根据2850 bp位点的T/C变异设计, 并依据引物错配原理在3′ 端第2位引入与A强错配的碱基G; 反向引物R3与6-SFT-D基因组特异引物R2相同。当2850 bp位点为T时扩增出500 bp左右的条带, 为C时无扩增条带。当等位基因特异PCR引物扩增结果是无带时, 则很难确定是PCR扩增确实没有目标带还是其他原因导致的检测不到扩增产物。为了增加实验的可靠性, 在此反应体系中加入了另一对引物F4/R4, 此对引物在所有的材料中都可检测到扩增产物。本试验中, 当2850 bp位点为T时扩增出两条带, 为C时扩增一条带(图6-B)。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 6-SFT-D序列的多态性位点 Table 1 Single nucleotide mutation in 6-SFT-D sequence 序号 No. 位点 Site 区域 Region 类型 Type 单核苷酸变异 Single nucleotide mutation (x/y) HapI HapII HapIII 1 475 bp intron 2 SNP C/A C C A 2 841 bp intron 2 SNP A/G A A G 3 2243 bp intron 3 SNP A/G G G A 4 2850 bp exon 4 SNP C/T C T C

表1 6-SFT-D序列的多态性位点 Table 1 Single nucleotide mutation in 6-SFT-D sequence

图6

Fig. 6

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图6 利用6-SFT-D等位特异引物检测的基因型Fig. 6 Genotypes detected by 6-SFT-D allele-specific primers

2.6.1 6-SFT-D不同单倍型与千粒重的关联分析

用AS-PCR标记扫描自然群体, 分子标记与农艺性状的关联分析表明, 2009年和2010年在灌溉条件下6-SFT-D基因两种单倍型HapI和HapII与千粒重显著相关, 基因型HapI较HapII的千粒重平均值分别高2.13 g和2.84 g。因此, HapI为灌溉条件下影响小麦千粒重的优异单倍型(表2)。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 灌溉条件下6-SFT-D两种单倍型与小麦千粒重和穗长的关联分析 Table 2 Association analysis between 6-SFT-D haplotype and TGW in wheat under well-watered condition 性状及其统计指标 Trait and its statistical parameters 2009 2010 HapI HapII HapI HapII 千粒重 Thousand-grain weight (g) 40.39± 4.60 38.26± 5.71 34.54± 7.37 31.70± 6.73 F值 F-value 4.525 4.335 P值 P-value 0.035 0.034 表型贡献率 Phenotypic variance explained (%) 2.460 1.940 穗长 Spike length (cm) 8.21± 1.27 7.84± 1.53 8.48± 1.36 8.06± 1.58 F值 F-value 3.942 5.301 P值 P-value 0.049 0.023 表型贡献率 Phenotypic variance explained (%) 1.840 2.500

表2 灌溉条件下6-SFT-D两种单倍型与小麦千粒重和穗长的关联分析 Table 2 Association analysis between 6-SFT-D haplotype and TGW in wheat under well-watered condition

2.6.2 6-SFT-D两种单倍型千粒重的积累

在灌浆进程的不同时期取样表明, 在灌浆初期(5月26日) HapI基因型的千粒重与HapII的千粒重差异不显著, 灌浆后期(6月2日至11日) HapI的千粒重均高于HapII (图7)。因此认为, HapI的品种灌浆速率比HapII的品种快, 使小麦籽粒成熟后HapI的小麦品种的千粒重显著高于HapII小麦品种。

图7

Fig. 7

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	图7 灌浆期6-SFT-D两种单倍型材料的千粒重增长情况(2010年)Fig. 7 Thousand-grain weight of two 6-SFT-D haplotypes during grain filling period in 2010

2.6.3 6-SFT-D两种单倍型与穗长的关联分析

两年分析结果表明, 在灌溉条件下6-SFT-D两种单倍型与穗长显著相关, HapI基因型的穗长较大, 2009年和2010年分别比HapII基因型高0.37 cm和0.42 cm (表2)。

普通小麦中, 6-SFT-D基因分为两种单倍型, 其中HapI为高千粒重的优异等位变异。小麦的6-SFT- A2基因分为3种单倍型, 与千粒重显著相关, 其中HapIII为6-SFT-A2的高千粒重优异等位变异^[20]。2007— 2010年连续4年分析6-SFT-D和6-SFT-A2不同单倍型组合基因型在雨养和灌溉条件下的表型性状, 发现同时含有基因优异等位变异HapI+III的小麦材料的千粒重平均值显著高于其他材料(图8); 而不带6-SFT-D与6-SFT-A2任何一个优异等位变异的HapII+I小麦材料, 其千粒重平均值低。如在2010年灌溉条件下, HapI+III小麦材料的千粒重平均值高达43.2 g, 含有任何一个基因优异等位变异小麦材料的千粒重平均值为39.3~41.1 g, 而没有优异等位变异的HapII+I和HapII+II基因型, 其千粒重平均值仅为39.2 g和36.6 g, 说明6-SFT-D和6-SFT-A2两个基因对千粒重的效应存在一定的累加作用。

图8

Fig. 8

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图8 不同环境条件下6-SFT-D与6-SFT-A2单倍型对千粒重的累加效应 DS和WW分别代表:雨养和灌溉条件, 其后数字表示年份, 如07表示2007年。每个柱形图上标的不同字母表示差异显著。Fig. 8 Accumulation effects on grain weight of 6-SFT-D and 6-SFT-A2 haplotypes in multi-environment DS and WW indicate drought stress and well-watered conditions, respectively. Numbers followed DS or WW refer to years, such as 07 for 2007. Different letters in column of each haplotype indicate significant differences between haplotypes.