供试玉米品种为郑单958; RNA提取试剂购买于华越洋生物科技有限公司; M-MLV反转录试剂盒购买于北京天根生化科技有限公司; 荧光定量试剂购买于宝生物工程大连有限公司TaKaRa; 丙环唑和石蜡购买于西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司Sigma-Aldrich。试验中所用其他试剂均为进口或国产分析纯试剂。

于恒温培养箱中进行沙培试验, 设4个Pcz浓度0、1.0、5.0和10.0 µ mol L^-1, 其中0 µ mol L^-1为对照, 每个处理3个重复, 完全随机排列。每个重复选饱满一致种子40粒, 用10% NaClO消毒, 在相应浓度Pcz溶液中室温浸种12 h。之后, 播于含300 mL相应浓度Pcz溶液的蛭石中, 保持相对含水量约为80%。25℃, 黑暗培养7 d, 测定幼苗中胚轴和胚芽鞘的长度。

于中国农业大学人工气候室中进行水培试验, 设置4个Pcz浓度0、0.2、1.0和5.0 µ mol L^-1, 其中0 µ mol L^-1为对照, 每处理4个重复。利用石英育苗至一叶一心, 挑选生长一致的幼苗移至霍格兰营养液中。2 d后, 移入含有不同浓度Pcz的霍格兰营养液中培养, 所有处理和重复完全随机排列。培养条件为光(24℃)、暗(18℃)各12 h, 室内相对湿度50%~60%, 光照强度400 µ mol m^-2 s^-1。3 d后取样, 观察、照相记录表型, 测定株高、根长、叶鞘长和生物量等指标。

Pcz处理3 h、12 h、24 h和72 h取样, 选取玉米第2叶鞘下部, 长度约为3 cm。将样品立即置于液氮中冷冻, 并保存于-80℃冰箱。采用华越洋生物公司的植物总RNA提取试剂盒提取玉米的总RNA, 反转录成cDNA。使用TaKaRa的Real-time PCR (SYBR)试剂盒, 荧光定量PCR仪(ABI7500)进行Real-time PCR。以ZmACTIN为内参, 测定相关基因的表达(表1)。15 µ L反应体系含2× SYBR Premix Ex Taq 7.5 µ L, 50× ROX Reference Dye II 0.3 µ L, 正向引物和反向引物(10 µ mol L^-1) 各0.3 µ L, cDNA模板(40 ng µ L^-1) 1.5 µ L, ddH₂O 5.1 µ L。采用两步法反应程序, 95℃ 5 min; 95℃ 10 s, 60℃ 34 s, 40个循环。根据各样品特定的荧光阈值下的Ct值, 采用2^{-Δ Δ Ct}法计算基因在不同样品中的相对表达量。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 qRT-PCR引物 Table 1 Primers used for qRT-PCR 引物名称 Primer name 正向引物 Forward primer (5° -3° ) 反向引物 Reverse primer (5° -3° ) ZmACTIN GATTCCTGGGATTGCCGAT TCTGCTGCTGAAAAGTGCTGAG ZmDWF4 TGGAGGACAGGCTTGAGAAG GCAAGAGGTCCAGGATCTGT ZmCPD GGTCTTCACTGCCGTTCATC TTAGCGAGCTCTGATCCTGG ZmGA20ox1 GCGCTACTGCTCTGAGATGA CACGGCGGGTAGTAGTTGAG ZmGA3ox1 GACTAGCCGATTGCAAAAGC TAGCTGCGGAACGGAATTAG ZmGA2ox5 GAGAGGTGTGGGTTCAGGTG CGAGCTTGCAATTACCCTGT ZmGA2ox8 GCGGGTGCACTAGACTACG GCATGGACCAGGGAGCAG ZmEXPA4 GTGCCGTGCCGCAAGTCC GCTGGCCGCCTTGACGCT ZmEXPA5 GCGCGTGATGATCGAGTG AACGTCTAGGCGGGTGCTA ZmXTH1 AAATTCAACACGGACGGCAC CTGCTCCTTGGAGTTGAAGC ZmXET1 GCTGAGAGACGAACTGAAGC GCCAGAATCAACGCCTTCAT

表1 qRT-PCR引物 Table 1 Primers used for qRT-PCR

Pcz处理后7 d, 取第2叶的叶片、叶鞘和叶枕中部, 长度为3~4 mm, 制作石蜡切片。将上述样品立即用含70%酒精的FAA固定液固定。抽真空10~20 min, 固定24 h。用酒精梯度脱水、浸蜡包埋后, 将修整好的蜡块置于石蜡切片机切片, 轮转式切片机型号为Leica RM2235, 厚度为10 µ m。展片后经梯度二甲苯和酒精脱蜡, 用番红-固绿染色, 加拿大树胶封片, Olympus彩色CCD光学显微镜观察和照相。

Pcz处理3 d取样, 称取每份样品0.2 g, 3个重复。用3 mL样品提取液研磨和提取。离心, 取上清液, 用氮气吹干, 用酶联免疫法测定^[15]。

采用 Microsoft Excel 2010和SPSS 18.0软件处理数据和统计分析。

从图1看出, 黑暗条件下, 用不同浓度的Pcz处理玉米7 d, 与对照相比, 玉米幼苗中胚轴的长度分

别减小了12%、23%和29%, 胚芽鞘的长度分别减小了22%、36%和39%。由此可知, Pcz处理显著地抑制了中胚轴和胚芽鞘的生长, 且随着Pcz浓度的增大抑制程度加强。

图1

Fig. 1

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	图1 Pcz对玉米幼苗中胚轴和胚芽鞘生长的影响 图中所示数据为3个独立重复的平均值和标准差(* P < 0.05)。Fig. 1 Effects of Pcz on mesocotyl and coleoptile of maize seedlings Bars show averages and standard deviations from three independent samples (* P < 0.05).

从图2和表2可见, 水培条件下, 用不同浓度的Pcz处理3 d, 与对照相比, 玉米幼苗的生长受到了显著的影响:地上部生物量减少, 株高降低, 叶片和叶鞘的长度变短, 叶片卷曲, 叶夹角变小。根的生长也受到了一定程度的抑制, 其中5 µ mol L^-1 Pcz对根的抑制达到了显著水平。

图2

Fig. 2

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	图2 Pcz对玉米幼苗生长的影响Fig. 2 Effects of Pcz on growth of maize seedlings

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 Pcz对玉米幼苗株高、根长和干物质积累的影响 Table 2 Effects of Pcz on plant height, root length, and dry matter accumulation of maize seedlings 处理 Treatment (μ mol L-1) 株高 Plant height (cm) 根长 Root length (cm) 叶鞘 Sheath (cm) 地上部干重 Dry weight of shoot (g) 根干重 Dry weight of root (g) 0 36.1± 0.8 30.2± 2.2 8.9± 0.6 0.29± 0.04 0.11± 0.02 0.2 33.1± 0.8* 32.4± 2.3 7.1± 0.6* 0.25± 0.04* 0.10± 0.02 1.0 30.6± 1.6* 31.5± 1.9 6.5± 0.2* 0.25± 0.04* 0.10± 0.02 5.0 25.4± 1.1* 25.9± 1.5* 6.2± 0.4* 0.19± 0.03* 0.08± 0.02* * 表示在0.05水平下显著。* Significant difference at the 0.05 probability level.

表2 Pcz对玉米幼苗株高、根长和干物质积累的影响 Table 2 Effects of Pcz on plant height, root length, and dry matter accumulation of maize seedlings

从图3可看出, Pcz处理玉米幼苗叶鞘中GA和BR含量与对照相比分别下降30%和80%, 差异达到显著水平。从图4可看出, Pcz处理下, GA合成酶基因GA20ox1和GA3ox1的表达模式不同:GA20ox1在处理24 h表达上调, 72 h表达下调; 而GA3ox1在处理过程中, 表达水平一直显著低于对照。GA钝化酶基因GA2ox5和GA2ox8在处理24 h表达上调, 加速GA的代谢, 72 h表达回调。然而, BR合成酶基因CPD和DWF4的表达与对照相比, 有上调的趋势。

图3

Fig. 3

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	图3 Pcz对玉米幼苗叶鞘中GA和BR含量的影响 图中所示数据为3个独立重复的平均值和标准差(* P < 0.05)。Fig. 3 Effects of Pcz on the content of GA and BR in sheath of maize seedlings Bars show averages and standard deviations from three independent samples (* P < 0.05).

图4

Fig. 4

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	图4 Pcz对玉米幼苗叶鞘中GA和BR代谢相关基因表达的调控 从玉米叶鞘中提取总RNA, 进行RT-qPCR分析。图中所示数据为3个重复的平均值和标准差(* P < 0.05)。Fig. 4 Regulation of Pcz on the expression of GA and BR metabolism genes in sheath of maize seedlings Total RNA were extracted from the sheath of maize seedlings, analyzed by RT-qPCR. Bars show averages and standard deviations from three independent samples (* P< 0.05).

从玉米幼苗叶片的纵切面看出(图5-a), 与对照相比, Pcz处理下叶片表皮细胞纵向伸长受阻, 引起叶片长度变短; 从玉米幼苗叶鞘的纵切面看出(图5-b), 与对照相比, Pcz处理细胞轴向生长受到了抑制, 引起叶鞘变短; 从玉米幼苗叶枕的纵切面看出(图5-c), 对照叶枕细胞排列较为松散, 但Pcz处理叶枕细胞排列紧密, 且细胞显著变小, 这导致了叶夹角变小。

图5

Fig. 5

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	图5 Pcz对玉米幼苗叶片不同组织中细胞显微结构的影响 (a)叶片的纵切面; (b)叶鞘的纵切面; (c)叶枕的纵切面。Bar=100 μ m。Fig. 5 Effects of Pcz on cellular microstructures of leaf different tissues of maize seedlings (a) Leaf blade longitudinal sections; (b) Leaf sheath transverse sections; (c) Pulvinus transverse sections. Bar=100 μ m.

从图6可看出, 与对照相比, Pcz处理扩张蛋白基因EXPA4的表达3 h下调40%左右, 24 h表达回调; EXPA5的表达在12 h和24 h下调50%左右, 72 h表达回调。与对照相比, Pcz处理后, 木葡聚糖内糖基转移酶XTHs家族的XTH1和XET1基因的表达一直处于被抑制的状态, 特别是XET1基因下降了5倍左右。

图6

Fig. 6

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	图6 Pcz对玉米叶鞘中EXPA4、EXPA5、XTH1和XET1基因表达的调控 从玉米叶鞘中提取总RNA, 进行RT-qPCR分析。图中所示数据为3个重复的平均值和标准差(* P < 0.05)。Fig. 6 Regulation of Pcz on expression levels of EXPA4, EXPA5, XTH1, and XET1 in sheath of maize seedlings Total RNA were extracted from the sheath of maize seedlings, analyzed by RT-qPCR. Bars show averages and standard deviations from three independent samples (* P< 0.05).