耐盐碱东北野生大豆(Glycine soja) G07256、肇东苜蓿(Medicago sativa)种子由东北农业大学农业生物功能基因重点实验室保存; 大肠杆菌DH5α 、酵母菌株AH109、农杆菌EHA105、植物超量表达载体pCAMBIA330035Su由东北农业大学农业生物功能基因重点实验室构建保存; 胶回收和质粒小提试剂盒购自Transgene公司, 由哈尔滨英俊生物公司完成引物合成及测序。

以TRIzol法^[16]从野生大豆的根中提取总RNA, 并反转录成cDNA。通过同源克隆方法, 以目的基因在大豆中的同源基因Glyma05g20710序列为模板设计基因特异引物(5° -GGCTTAAUATGGCCGTGGAC CTC-3° 和5° -GGTTTAAUTCAAGACGATTCTAGAA TGAGATT-3° )。以稀释5倍的总cDNA为模板, 利用pfu DNA聚合酶进行PCR扩增^[17]。根据PCR产物对照Marker的位置回收目的条带。

对21 d龄的野生大豆幼苗进行碱胁迫(50 mmol L^-1NaHCO₃)处理, 分别在处理0、1、3、6、12和24 h后迅速剪取根尖部分; 此外, 选取2个月左右, 正处于生殖生长阶段的野生大豆的根、茎、胚、下胚轴、老叶、新叶、花和豆荚。提取总RNA, 并反转录成cDNA, 利用荧光定量PCR检测基因表达量。采用比较CT法(2^{-Δ Δ CT})定量分析, 以GAPDH (GenBank登录号为DQ355800)为内参基因, 设置3次独立生物学重复和3次技术重复, 数据取3次重复的平均值。参照文献^[18]原始数据标准化处理的方法。

利用USER技术^{[19, 20]}将目的片段与pCAMBIA330035Su载体快速融合, 以Bar基因作为筛选标记基因, 采用冻融法将构建成功的植物表达载体转化到根癌农杆菌EHA105中。

参照盛慧等^[21]方法, 稍作优化。对苜蓿子叶节进行2~3 d的预培养后, 用含有GsWRKY15基因的根癌农杆菌EHA105对子叶节进行侵染, 将侵染后的子叶节转移到共培养基中培养3~4 d, 再转移到含有100 mg L^-1阿莫西林-克拉维酸钾的液体植物培养基中冲洗3~4次, 随后转移到具有草甘膦(0.5 mg L^-1)筛选压力的除菌培养基上, 进行2周的除菌筛选培养, 待外植体分化出抗性不定芽。将其转入具有相同筛选压力的伸长除菌培养基上继代培养2周, 获得大量抗性不定芽, 当抗性芽伸长至3~4 cm高时, 将其从外植体基部剪下, 接种到生根培养基上培养。当植株根系生长至2~3 cm长时, 进行2~3 d的驯化。然后将抗性苗移栽到花盆中培养。

提取再生植株叶片DNA作为模板, 非转基因植株叶片DNA作为阴性对照的模板。利用Bar基因特异引物(5° -TGCACCATCGTCAACCACTACATCG-3° 和5° -CCAGCTGCCAGAAACCCACGTCATG-3° )对抗性植株进行PCR检测, PCR产物长度为450 bp。

以CTAB法提取PCR阳性植株的总DNA, 参照丁晓东等^[22]方法。利用GsWRKY15基因特异性引物, 从植物表达载体上克隆探针。方法参照Mishra等^[23]总DNA经过酶切后纯化、电泳、转移印记、固定、预杂交、杂交等步骤, 对PCR阳性植株进行Southern blot检测。

提取PCR阳性植株的总RNA, 以其为模板, 用内参基因GAPDH的特异性引物(5° -GACTGGTATG GCATTCCGTGT-3° 和5° -GCCCTCTGATTCCTCCTT G-3° )进行PCR扩增, 验证基因组DNA, 确定无污染后反转录成cDNA。以稀释5倍的苜蓿cDNA为模板, 用基因特异引物进行半定量RT-PCR检测。

方法参照王臻昱等^[10], 稍作改进。通过扦插繁殖的方式获得转基因苜蓿扦插苗, 对扦插苗进行耐碱性分析。在苜蓿生长茂盛的季节, 以每2~3个节点剪为一段, 在稀释1:5000的生根粉溶液中浸泡2 h后, 插入蛭石、草炭土和珍珠岩(1:1:1)混合的基质中。白天用遮阳网覆盖降温、保湿, 早晚各喷灌一次, 每次0.5 h, 并保持湿度80%和温度26℃, 在温室中培养约2周至生根, 移栽到蛭石和珍珠岩(1:1)的混合基质中, 每2 d用1/8 Hoagland营养液浇灌一次。培养4周左右, 挑选生长健壮且状态一致的扦插苗进行碱胁迫处理, 用含有0、100和150 mmol L^-1 NaHCO₃营养液浇灌, 2周后观察照相并记录表型。

采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法^[24]测定丙二醛(MDA)含量; 利用电导率仪检测叶片的相对电导率^[25], 测定相对质膜透性; 采用80%丙酮抽提比色法^[26]测定叶片中叶绿素含量。所有生理指标均设置3次重复, 用SPSS13.0检验显著性, Microsoft Excel 2007制图。

将非转基因和转基因苜蓿分别置于100 mmol L^-1NaHCO₃条件下处理0、1、3、6、12和24 h后, 剪取苜蓿叶片。参照1.2方法, 提取苜蓿叶片总RNA并反转录成cDNA。参照1.4方法, 选取胁迫相关基因H⁺-Ppase、NADP-ME、KIN1和RD29A, 分析其在非转基因和转基因苜蓿中的表达模式。

2.1.1 基于RNA-seq测序数据的GsWRKY15筛选

利用前期野生大豆盐碱胁迫RNA-seq测序数据, 从构建的碱胁迫基因调控网络中筛选得到碱胁迫下显著上调表达的GsWRKY15基因。由RNA-seq测序数据结果(图1)可以看出, 野生大豆根中GsWRKY15基因受碱胁迫诱导表达, 在碱胁迫下处理1 h时表达量最高。因此推测GsWRKY15可能在植物响应碱胁迫的过程中具关键作用。

图1

Fig. 1

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	图1 GsWRKY15基因在碱胁迫下RNA-seq测序数据分析Fig. 1 RNA-seq data analysis of GsWRKY15 gene expression patterns under alkaline stress

2.1.2 GsWRKY15基因的克隆 根据与GsWRKY15同源的大豆基因Glyma05g20710序列, 设计基因特异性引物, 以野生大豆cDNA为模板, 使用高保真酶Pfu DNA聚合酶进行PCR扩增。通过电泳结果(图2)及NCBI序列分析, 发现GsWRKY15基因大小为1005 bp, 编码335个氨基酸。

图2

Fig. 2

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	图2 GsWRKY15的克隆Fig. 2 Cloning GsWRKY15gene M: DL2000 marker.

2.2.1 碱胁迫下GsWRKY15基因的表达模式分析

以荧光定量PCR验证GsWRKY15基因在50 mmol L^-1 NaHCO₃胁迫下野生大豆根中的表达特性表明, GsWRKY15基因受碱胁迫明显上调表达, 且在1 h时表达量最高(图3), 虽然表达量与RNA-seq数据有所不同, 但趋势是基本一致的, 说明该基因受碱胁迫诱导表达。

图3

Fig. 3

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	图3 GsWRKY15基因在碱胁迫下表达模式Fig. 3 GsWRKY15 gene expression pattern under alkaline stress

2.2.2 GsWRKY15基因的组织定位分析 荧光定量PCR分析表明, 该基因在野生大豆根、下胚轴、茎、老叶、幼叶、果实和花中均有表达, 且不同组织之间的表达量存在差异, 该基因在花中的表达量最高, 其次是幼叶, 在胚中的表达量最低(图4)。说明GsWRKY15基因在野生大豆各组织中的分布具有特异性, 其行使功能的主要部位可能在花和幼叶中。

图4

Fig. 4

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	图4 GsWRKY15基因的组织定位分析Fig. 4 Locating analysis of GsWRKY15 gene in different tissues

2.3.1 植物表达载体构建 将克隆得到的GsWRKY15基因插入由35S启动子调控的植物表达载体pCAMBIA330035Su, 成功构建植物超量表达载体(图5-A)。将构建的植物超量表达载体转入大肠杆菌DH5α , 挑取阳性克隆摇菌并提取质粒(图5-B), 送交公司测序。以测序结果正确的质粒, 利用冻融法转化根癌农杆菌EHA105。

图5

Fig. 5

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	图5 植物表达载体构建与转化农杆菌后菌落PCR鉴定 M: DL2000 maker; +: 阳性对照; -: 阴性对照; 1~3: 菌落PCR产物。Fig. 5 Construction of plant expression vector and PCR identification of transformed agrobacterium M: DL2000 maker; +: positive plasmid; -: negative control; 1-3: PCR products of bacterial colony.

2.3.2 转基因苜蓿抗性植株的获得 采用农杆菌介导法将植物表达载体pCAMBIA330035Su- GsWRKY15转入苜蓿中。经过种子萌发、形成无菌苗、子叶节农杆菌共培养、抗性不定芽诱导及筛选、诱导生根等过程, 共获得39株抗性再生植株。

2.4.1 再生植株的PCR、Southern blot鉴定 对获得的转GsWRKY15基因的39株再生植株进行PCR检测。其中, 含有GsWRKY15基因的重组质粒作为阳性对照, 水和非转基因植株的DNA作为阴性对照(图6-A)。经PCR检测, 最终获得转GsWRKY15基因PCR阳性植株16株, 转化率为41.03%。Southern blot (图6-B)结果显示, #5、#17、#23株系为Southern blot阳性株系, 且均为单拷贝株系。

图6

Fig. 6

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图6 再生植株的分子生物学鉴定 A: 再生植株的PCR检测; B: PCR阳性植株的Southern blot鉴定; C: PCR阳性植株的RT-PCR检测。M: DL2000 marker; +: 阳性对照; -: 阴性对照; WT: 非转基因株系; 1~19: 部分转基因株系; #5, #17, #23: 转基因株系。Fig. 6 Molecular biological identification of regeneration plants A: PCR identification of regeneration plants; B: Southern identification of PCR positive plants; C: RT-PCR identification of Southern blot positive plants. M: DL2000 marker; -: negative control; WT: non-transgenic plants; +: positive control; 1-19: partial transgenic lines; #5, #17, #23: transgenic lines.

2.4.2 Southern blot阳性植株的RT-PCR鉴定

半定量RT-PCR方法对Southern blot阳性株系检测(图6-C)显示, GsWRKY15基因在#5、#17、#23转基因苜蓿中能够转录表达, 而非转基因株系中未检测到阳性信号。最终确定3株转基因株系。

2.5.1 碱胁迫下转基因苜蓿的表型分析 选取RT-PCR阳性植株#5、#17转基因株系进行表型分析。对非转基因和转基因株系分别进行0、100和150 mmol L^-1NaHCO₃处理, 2周后发现, 未处理组中, 非转基因和转基因株系生长状况良好且相对一致(图7-A)。在100 mmol L^-1 NaHCO₃胁迫处理下, 转基因植株生长状况良好, 而非转基因株系苜蓿叶片逐渐萎蔫失绿(图7-B)。在150 mmol L^-1 NaHCO₃处理下, 转基因苜蓿受到影响较轻, 仍能正常生长, 而非转基因植株碱害较重, 生长发育受到抑制, 叶片萎蔫、失绿(图7-C), 说明转基因株系耐碱性明显好于非转基因株系。

图7

Fig. 7

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	图7 转基因苜蓿碱胁迫下的表型 A、B和C分别为0、100和150 mmol L-1NaHCO3处理2周后的表型; WT: 非转基因对照; #5和#17: 转GsWRKY15基因株系。Fig. 7 Phenotype of transgenic alfalfa with GsWRKY15 under alkaline stress A, B, and C are phenotype of alfalfa treated with 0, 50, and 100 mmol L-1NaHCO3 for 14 days; WT: non-transgenic alfalfa; #5 and #17: transgenic alfalfa plants with GsWRKY15.

在0、100和150 mmol L^-1NaHCO₃胁迫处理下, 所有株系的株高和根长随NaHCO₃处理浓度的增高而下降, 但转基因株系#5、#17的下降幅度均小于非转基因株系(图8)。由此表明, GsWRKY15基因的超量表达, 提高了转基因苜蓿的耐碱性。

图8

Fig. 8

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	图8 碱胁迫对转GsWRKY15基因苜蓿株高和根长的影响 * 表示在P< 0.05水平差异显著。Fig. 8 Changes of plant height and root length of transgenic alfalfa with GsWRKY15 under alkine stress * indicates significantly different at P< 0.05.

2.5.2 碱胁迫下转基因苜蓿的生理指标检测 图9-A显示, 转基因和非转基因株系的MDA含量随碱胁迫浓度的升高而增加, 但2个转GsWRKY15基因苜蓿株系的MDA含量增加幅度显著低于非转基因对照株系(P< 0.05), 从而说明超量表达GsWRKY15基因可降低碱胁迫对转基因苜蓿细胞膜的过氧化损伤, 转基因苜蓿耐碱性更高。

图9

Fig. 9

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	图9 碱胁迫下转基因植株的生理指标 * * 和* 分别表示在P< 0.01和P< 0.05水平差异显著。A: 丙二醛含量; B: 叶绿素含量; C: 相对质膜透性。Fig. 9 Physiological indexes of transgenic plants under alkali stress * * and * indicate significantly different at P< 0.01 and P< 0.05, respectively. A: MAD content; B: chlorophyll content; C: relative membrane permeability.

图9-B显示, 随着碱胁迫浓度的增加, 2个转GsWRKY15基因苜蓿株系和非转基因对照株系的叶绿素含量均随之降低, 但相同的碱胁迫浓度处理条件下, 转基因株系的叶绿素含量均高于非转基因株系, 在150 mmol L^-1NaHCO₃处理条件下最为明显, 2个转基因株系的叶绿素含量均显著高于非转基因对照株系(P< 0.05), 显然在碱胁迫条件下转GsWRKY15基因苜蓿株系的叶绿体受伤害的程度小, 具有更强的光合能力, 具有更高的耐碱性。

图9-C表明, 转基因和非转基因苜蓿的相对质膜透性均随着碱胁迫浓度的增加而增加, 但转基因植株相对质膜透性的增加幅度显著低于非转基因对照植株(P< 0.05), 说明在碱胁迫条件下, 转GsWRKY15基因株系细胞膜所受的损害较轻, 具有较高的耐碱能力。

为了检验GsWRKY15基因在苜蓿中的超量表达是否影响了胁迫相关基因的表达, 从而使转基因苜蓿在生理水平上表现出耐碱特性, 对胁迫相关基因在转基因和非转基因苜蓿中的表达量进行了分析, 包括H⁺-Ppase、NADP-ME、KIN1、RD29A。通过荧光定量PCR分析发现, 转基因和非转基因植株中这4个基因都被碱胁迫诱导表达, 且具有相似的表达模式, 但转基因株系的表达量均高于非转基因植株(图10)。由此表明, GsWRKY15基因作为转录因子可能通过调节这些基因的转录来提高植株耐碱性。

图10

Fig. 10

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	图10 胁迫相关基因在转基因和非转基因苜蓿中的表达模式Fig. 10 Expression patterns of stress-responsive genes in transgenic and non-transgenic alfalfa