将玉米品种豫单916种植于河南农业大学农场(郑州), 常规田间管理, 于灌浆期选取根(地下节根和地上气生根)及不同叶位的叶片、叶脉、叶鞘、节、节间、穗柄、苞叶和籽粒, 快速清洗、剪碎, 于液氮中速冻, 置-80℃保存备用。

称取0.5 g不同组织部位的样品, 加液氮研磨, 再加3倍体积的提取缓冲液(100 mmol L^-1 Tris-HCl, pH 7.6, 1 mmol L^-1 EDTA, 1 mmol L^-1 MgCl₂和10 mmol L^-1 β -巯基乙醇^{[13, 22]})混成匀浆, 冰浴静置30 min后, 4℃、13 000× g离心30 min, 上清液即粗酶提取液。

利用3种凝胶电泳系统分离鉴定GS同工酶。

1.3.1 不连续活性聚丙烯酰胺凝胶电泳系统(Native- PAGE) 由3%的浓缩胶(pH 6.7)和5%的分离胶(pH 8.7)组成, 用于玉米不同组织器官的蛋白提取液中GS同工酶亚型的分离和酶活性检测^[22]。4℃预冷电极缓冲液(25 mmol L^-1 Tris, 192 mmol L^-1甘氨酸), 粗酶液与5× 上样缓冲液[25 mmol L^-1 Tris-HCl, pH 7.6, 5% (w/v) β -巯基乙醇, 0.05% (w/v)溴酚蓝, 50% (v/v)甘油]混匀后上样, 于4^° C条件下电泳, 浓缩胶稳压80V, 分离胶稳压120 V。

1.3.2 Blue native PAGE (BNE) 依据Wittig等^[18]改良BNE电泳方案, 根据GS同工酶全酶大小进行分离并鉴定其相对分子质量。凝胶由3%的浓缩胶和4%~13%的梯度分离胶组成, 样品处理同Native-PAGE, 加入预冷阳极缓冲液(25 mmol L^-1咪唑-HCl, pH 7.0), 首先使用阴极电泳缓冲液A (0.02% Coomassie Blue G250, 50 mmol L^-1 Tricine-HCl, 5 mmol L^-1咪唑, pH 7.0), 于4^° C、100 V电泳20min后, 更换为阴极电泳缓冲液B (50 mmol L^-1 Tricine-HCl, 5 mmol L^-1咪唑, pH 7.0), 继续电泳至样品进入4%~13%的梯度分离胶, 然后进行稳流(15 mA)电泳至蓝色指示剂出胶^[22]。

1.3.3 Clear native PAGE (CNE) 参考Wittig等^[19], 凝胶体系和BNE一样, 但只使用阴极电泳缓冲液B, 于100V电泳至样品进入分离胶, 然后进行稳流(15 mA)电泳至蓝色指示剂出胶。

胶内GS活性依据Wang等^[22]方法检测, 活性染色结束后扫描结果, 然后再用考马斯亮蓝R250染色。BNE胶中, 以高分子蛋白Marker (Amersham HMW Calibration Kit For Native Electrophoresis)为标准, 利用Gel-Pro analyzer计算GS同工酶全酶的相对分子质量。

取适量粗酶提取液与等体积2× 的上样缓冲液[100 mmol L^-1 Tris-HCl, pH 6.8, 4% (w/v) SDS, 10% (v/v) β -巯基乙醇, 0.2% (w/v)溴酚蓝, 20% (v/v)甘油]混合, 沸水浴5min变性处理, 室温条件下利用SDS-PAGE (5%浓缩胶, 12%分离胶)分离蛋白质, 将蛋白转移至PVDF膜上进行Western-blot检测。使用本实验室制备的小麦GS多克隆抗体检测玉米GS亚基, 使用Bio-Rad Clarity Western ECL试剂盒显色, 以蛋白Marker (Thermo Scientific PageRuler Prestained Protein Ladder)为标准, 利用Gel-Pro analyzer计算GS同工酶亚基分子质量。

切取BNE胶条, 浸泡于含1% SDS和1% β -巯基乙醇的变性液中, 37℃变性处理2 h^[18], 然后用去离子水冲洗凝胶3~5次, 置SDS-PAGE浓缩胶顶部, 室温条件下电泳。电泳结束后, 将蛋白质转移至PVDF膜上进行Western blot分析。

Western blot结果显示玉米中有3种GS亚基, 即40 kD和39 kD的胞液型GS (GS1)及44 kD的质体型GS (GS2), 且不同组织器官中GS同工酶表达差异较大(图1-A)。40 kD的GS1在玉米中起主导作用, 不同组织器官均有较大的表达量(籽粒除外); 39 kD的GS1仅在穗位节间、节和果穗柄中表达, 且后2个部位表达量较高, 可能与玉米灌浆期氮素营养的运输有关; GS2只在功能叶的叶片、叶脉中少量表达, 可能与玉米是C₄植物, 光呼吸强度低有关。Native-PAGE结合胶内GS酶活性分析显示(图1-B), 玉米根系、叶片、茎节、穗柄等组织中均检测到GS活性带, 叶片中最高, 籽粒中最低; 但叶片提取液中仅检测到1条GS活性带, 可能因GS2活性太低或不连续Native-PAGE分离蛋白质的特点导致的2种GS同工酶没有被分离开; 此外与Western blot结果一致, 在含两种GS1亚基的穗位节和果穗柄中检测到2个GS同工酶。

图1

Fig. 1

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图1 玉米不同组织GS同工酶表达和活性分析 (A) Western blot鉴定GS同工酶亚基的表达。12% SDS-PAGE分离玉米蛋白, 转膜后利用小麦GS多克隆抗体检测GS亚基。(B)胶内GS酶活性检测。以5% Native-PAGE分离组织蛋白, 胶内GS酶活性分析检测GS同工酶活性。Roots: 根; Lower 1th leaf: 穗下第1叶; Sheath: 穗位叶鞘; Ear leaf: 穗位叶; Vein: 穗位叶叶脉; Internode: 穗位节间; Node: 穗位节; Pedicel: 果穗柄; Husk leaves: 苞叶; Grain: 籽粒; Top leaf: 顶部功能叶。Fig. 1 Analysis of the expression and activity of GS isoforms from different tissues of maize (A) Expression of GS isoforms detected by Western blot. Protein extracts separated by 12% SDS-PAGE, and then probed with GS ployclonal antibodies against wheat after electrobloting. (B) In-gel detection of GS activity. Proteins from different tissues were separated by 5% Native-PAGE, and GS isoforms were detected with the in-gel GS activity analysis.

通过改良BNE方法, 在玉米叶片和穗位节间、节和果穗柄中检测到2个大小不同的GS活性带, 其他组织中则只检测到一条GS带(图2-A)。其中, 迁移率较大的GS同工酶全酶分子量约240 kD, 活性较低; 迁移率较小的GS同工酶分子量约410 kD, 活性非常高。利用BNE分离玉米叶片总蛋白后, 进行Western blot, 检测到一个相对分子质量约460 kD的GS同工酶(图2-C), 可能因其活性低, 且分子量接近RuBP羧化酶, 其活性被羧化酶的蓝色条带遮盖^[22]。

图2

Fig. 2

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图2 玉米GS同工酶全酶大小鉴定 (A)以BNE分离玉米不同组织可溶蛋白, 以胶内转移酶活性检测GS同工酶。(B) BNE胶考马斯亮蓝染色, 参照蛋白marker, 利用Gel-Pro analyzer计算GS同工酶全酶大小。(C)以BNE/CNE分离玉米穗位叶可溶蛋白, 转膜后进行Western blot检测。Fig. 2 Identification of the molecular weight of GS holoenzymes (A) Soluble proteins from different tissues of maize were separated by BNE, and GS isoforms were detected with an in-gel transferase activity assay. (B) CBB-staining after BNE, the molecular weight of GS holoenzymes were estimated using Gel-Pro analyzer with the calibration of the protein marker. (C) Proteins from the ear leaf of maize were separated by BNE/CNE, and GS isoforms were detected by Western blot.

第一相胶为BNE, 用以分离玉米组织蛋白复合体, 切取相应组织的泳道进行蛋白质变性处理; 第二相胶为SDS-PAGE, 对BNE上的蛋白质复合体的亚基进行电泳分离; 然后转膜, 利用Western blot鉴定玉米组织中GS同工酶的亚基组成。玉米叶片中分子量约460 kD的GS同工酶(图2-A)由44 kD的亚基组成且信号非常弱(图3-A), 为GS2; 分子量约410 kD和240 kD的GS同工酶由39~40 kD的亚基组成且信号非常强, 为GS1, 表明胞液型GS存在两种不同的聚合方式。玉米穗柄中只有分子量约410 kD和240 kD的GS同工酶, 也是由39~40 kD的亚基组成, 说明穗柄中GS1全酶也存在两种不同的聚合方式。

图3

Fig. 3

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图3 玉米GS同工酶亚基组成的鉴定 (A)玉米穗位叶GS同工酶亚基组成鉴定, 利用BNE分离叶片可溶蛋白, 切取相应泳道进行变性处理, 利用SDS-PAGE分离复合体亚基, Western blot检测GS亚基。(B)穗柄中GS同工酶亚基鉴定, 方法步骤同(A)。Fig. 3 Identification of the subunit composition of GS isoenzymes in maize (A) Identification of the subunit composition of GS isoenzymes in the ear leaf of maize. Proteins were separated by BNE, the corresponding gel lane was cut out and denaturalized, and the protein complexes were separated by SDS-PAGE, then the GS subunits were identified by Western blot. (B) Identification of the subunit composition of GS isoenzymes from the pedicel of maize, the procedure was the same as that of (A).

利用BNE计算GS同工酶的全酶大小(图2), 利用BNE与SDS-PAGE结合进行两相电泳分离GS同工酶亚基, 利用Western blot检测鉴定GS同工酶亚基组成(图3)。利用GS同工酶分子量除以相应亚基的分子量, 在此基础上计算GS同工酶聚合状态, GS2为十聚体, 胞液型GS1有2种聚合方式, 一种为十聚体, 和前人结果一致^[15]; 此外, GS1同工酶还存在另外一种聚合状态, 即五聚体。