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干旱是造成向日葵减产的最主要因素之一。利用综合性状优良的自交系K55作为轮回亲本与抗旱自交系K58杂交构建回交导入系, 在干旱条件下进行单株产量筛选, 得到45个BC3F2抗旱定向选择导入系。通过全基因组SSR及SNP标记扫描, 以方差分析和基于遗传搭车原理的卡方检验对呼和浩特市及武川县两点、两种水分条件下的5个产量性状进行QTL检测。方差分析检测到的QTL根据不同环境下的表达情况分为三类, 第一类在两种水分条件下稳定表达, 包括武川的4个百粒重QTL及呼和浩特的2个单株产量QTL、3个单株实粒数QTL, 这些QTL可能对向日葵抗旱性有直接贡献; 第二类受干旱胁迫表达, 包括呼和浩特的30个和武川的27个; 第三类仅在正常供水条件下被检测到, 包括呼和浩特的38个和武川的64个。卡方检验检测到极显著位点274个。用两种方法共检测到一致性位点14个, 可能是与向日葵抗旱性相关的关键位点。本研究结果可为向日葵高效抗旱分子育种奠定基础并提供相关材料。
Drought is one of the most important factors to decrease the yield of sunflower. The BC3F2 selected backcrossing introgression lines of oil sunflower population including 45 lines were developed by drought-tolerance screening for yield using Helianthus annuus K55 with excellent comprehensive characters and drought sensitivity as recurrent parent and K58 with drought-tolerance as donor parent. The genotypes of selected backcrossing introgression lines were obtained with the whole genome SSR and SNP markers. QTLs affecting five yield traits were detected under both drought stress and well watered conditions in Hohhot and Wuchuan respectively by one-way ANOVA and Chi-square test based on the Genetic Hitchhiking Effect. The QTLs detected by one-way ANOVA were grouped into three types based on their behaviors: type I was the QTLs detected in both watered conditions, including four QTLs affecting hundred-seed weight (HSW) in Wuchuan and two QTLs affecting seed yield (SY) and three QTLs affecting filled seeds per plant (FSP) in Hohhot, which were considered to be able to directly contribute to drought tolerance; type II was the QTLs detected only under drought stress, including 30 QTLs in Hohhot and 27 QTLs in Wuchuan; type III was the QTLs detected only in well watered condition, including 38 QTLs in Hohhot and 64 QTLs in Wuchuan. There 274 loci were detected by chi-square test, among them 14 loci could be detected by ANOVA and chi-square test simultaneously, which might be the key loci for drought tolerance of sunflower. The results lay a foundation of efficient drought tolerance molecular breeding and provide useful drought tolerance materials for sunflower.
我国是向日葵种植大国, 西北、华北及东北的干旱、半干旱地区是主要的向日葵种植区, 这些地区降水量不足且时空分布不均, 干旱是向日葵减产的最主要因素之一。干旱对作物的影响最终体现在产量上, 直接以产量进行选择可以有效提高作物的抗旱性[1-2]。产量及抗旱性均属于多基因控制的数量性状, 随着分子标记技术的发展, 可定位目标数量性状位点(QTL), 通过QTL的准确追踪, 挖掘与耐旱基因紧密关联的分子标记, 促进分子标记辅助选育(MAS), 可以加快培育耐旱品种的进程[3]。
向日葵抗旱QTL定位研究多利用自交系群体进行[4, 5, 6, 7]。自交系定位易受背景干扰, 研究群体脱离育种实践, 再加上产量及抗旱性本身的复杂性, 存在定位精度不高的问题。高代回交导入系群体可有效克服此类缺陷, 尤其是Li等[8]提出的选择导入系概念, 推动了作物QTL准确定位与基因型分析的发展[9]。利用选择导入系进行QTL定位的研究在水稻、大豆中报道较多[10-18], 卓壮[11]利用黄华占为轮回亲本构建的两个抗旱选择群体分别定位到20个和11个产量性状位点; 赵秀琴等[12]利用Lemont导入到特青背景的高代回交导入系在2种水分条件下检测到籽粒产量及其穗部相关性状QTL 32个, 其中对耐旱性可能有直接贡献的为在两种条件下均检测到的3个QTL (QGn11b、QGn12和QGn11b)及影响两种条件下性状差值的9个QTL; 李灿东等[17]对36个耐旱定向选择导入系进行方差分析共检测到14个控制相对发芽率的QTL, 其中Satt156、Satt423、Sattt167等位点与卡方测验检测的结果具有一致性。但利用抗旱选择群体进行QTL的定位在向日葵上还未见报道。本研究利用油用向日葵高代回交抗旱选择导入系群体, 以SSR及SNP标记进行基因型分析, 在干旱胁迫和正常供水条件下定位产量性状的QTL, 研究结果可为向日葵抗旱及产量性状QTL的精细定位、克隆及向日葵高效抗旱分子育种奠定基础。
选取油用向日葵抗旱自交系K58为供体亲本、综合性状优良的非抗旱自交系K55为轮回亲本杂交后再回交2代, 产生BC2F1群体。2013年春季, 将BC2F1群体种植于内蒙古农业大学试验农场, 与轮回亲本K55继续回交并进行抗旱初次筛选, 田间干旱胁迫处理为作水播种后全生育期雨养, 成熟期收获单株产量高于轮回亲本的单株, 共得到80个BC3F1单株。2013年冬季, 将80个BC3F1单株材料种植于海南, 进一步抗旱筛选, 田间处理同2013年春季, 自交套袋, 成熟期收获产量高于轮回亲本的单株, 共45株作为试验材料。
2014年和2015年春季, 将筛选到的45个BC3F2株系及其亲本分别种植于内蒙古呼和浩特市内蒙古农业大学农场(两年间全生育期降雨量分别为364.9 mm和274.9 mm)和内蒙古武川县农业部内蒙古耕地保育科学观测实验站(两年间全生育期降雨量分别为366.1 mm和307.5 mm), 两点均采用随机区组设计, 3次重复, 2个处理(干旱胁迫和正常供水条件, 两处理间设置隔离区), 行长4 m, 行株距0.50 m× 0.35 m, 干旱胁迫处理为作水播种后全生育期完全雨养, 正常供水条件为播种期、现蕾期和花末期灌水3次。
考察2点(呼和浩特和武川)、2种水分条件下(干旱胁迫和正常供水)的5个产量性状, 成熟后每小区选取5株测量花盘直径(DS, cm), 单株收获。收获后单株脱粒晒干至种子含水量8%以下, 测量单株产量(SY, g plant-1)、百粒重(HSW, g), 数取单株实粒数(FSP), 计算结实率(SSR, %), 结实率=单株实粒数/ (单株实粒数+空粒数)× 100%。
选取向日葵苗期鲜嫩真叶, 用TIANGEN试剂盒提取双亲及选择导入系群体的基因组DNA。利用已有在亲本K55、K58间具有多态性的177对SSR引物[7]对抗旱选择群体进行标记分析, 参照房冬梅改进的PCR体系及程序 [19], 由北京百迈克生物科技有限公司对双亲及选择导入系群体进行高通量测序开发SNP标记。
SSR及SNP标记条带统计以亲本为依据, 将与轮回亲本K55相同的带型记为“ A” , 与供体亲本K58相同的带型记做“ B” , 杂合型条带记为“ H” , 模糊不清或者缺失的带型记为“ -” 。使用引物名称命名SSR标记, 同一引物扩增出多条多态性位点的情况以“ -1、-2、-3” 等区分, 顺序为片段由大到小; 使用M+数字命名SNP标记。
根据遗传搭车理论[20]及基因型数据, 将选择群体的供体等位基因导入频率与BC3代的预期值(0.0625)的偏离情况进行卡方检测, 显著水平为P< 0.005, 当某一片段可能携带有与目标性状有关的QTL时, 其供体片段的基因型频率将显著偏离其期望频率。
以5株平均值代表该株系性状值, 2年间3次重复的平均值进行数据分析和QTL定位。对抗旱选择群体及亲本的目标性状计算平均值及标准差, 利用两点、两种水分条件下分别测得的产量性状数据, 采用SAS PROC GLM 软件进行性状-标记间单向方差分析检测QTL, 显著水平为P< 0.001。在QTL定位过程中, 为了避免采用同一个固定的阈值时出现在一个环境下检测到QTL在另一个环境下却检测不到的情况即统计学上第II类错误, 可将受环境影响较大的性状的阈值进行调整[21], 用P< 0.01或P< 0.05作为该性状QTL定位的显著水平, 将结果一并列出。采用地点+QTL+性状命名QTL, 性状以英文缩写表示, 地点以大写首字母代表(呼和浩特H, 武川W)。同一性状的多个QTL以“ -1、-2、-3” 等区分。
从轮回亲本及供体亲本两点的产量表现(表1)看出, 干旱胁迫条件下两点轮回亲本单株产量降低8.61 g (30.16%)、9.61 g (33.60%), 供体亲本单株产量降低6.30 g (19.02%)、7.02 g (21.89%)。与正常供水条件相比, 干旱胁迫下两亲本的其余各性状值在两点间亦表现降低, 且不同性状对水分胁迫响应有所差异。两点间两种水分条件下轮回亲本百粒重均优于供体亲本, 盘径略优于供体亲本, 其他性状则供体亲本优于轮回亲本。
选择群体各产量性状在两点间均表现为正常供水条件下优于干旱条件。与轮回亲本相比, 选择群体干旱胁迫条件下除呼和浩特的盘径及两点间百粒重低于轮回亲本外, 其余各性状均优于轮回亲本, 其中2点间单株产量高于轮回亲本1.65 g (8.27%)、0.70 g (3.69%), 结实率高于轮回亲本4.70%、10.00%, 单株实粒数高于轮回亲本85.7个(18.12%)、62.8个(13.39%); 正常供水条件下除武川的盘径及呼和浩特的百粒重低于轮回亲本外, 其余各性状均优于轮回亲本, 其中两点间单株产量高于轮回亲本2.74 g (9.60%)、9.78 g (34.20%), 结实率高于轮回亲本6.16%、10.11%, 单株实粒数高于轮回亲本100.8个(17.11%)、210.0个(36.78%)。说明回交育种结合外部选择的策略能够使轮回亲本优良性状得到保持的同时弥补了轮回亲本的不足, 使轮回亲本得到改良。
通过178个SSR标记和2433个高质量SNP标记分析得到的供体基因导入频率与BC3代预期值(0.0625)进行卡方检验, 检测到0.005水平下的极显著位点274个(表2), 卡方值范围8.01~70.86。这些位点可能与抗旱性密切相关。
在呼和浩特市和武川县两点的干旱胁迫及正常供水条件下, 通过性状-标记间单项方差分析检测到154个QTL (表3和表4) , 可分为三类, 第一类为两种水分条件下稳定表达的QTL; 第二类为受干旱胁迫诱导表达的QTL; 第三类为仅在正常供水条件下表达的QTL。
检测到影响单株产量的QTL 44个: 第一类QTL仅在呼和浩特检被测到2个(H-Qsy-23和H-Qsy-24), 增加目标性状的等位基因均来自供体亲本K58。第二类QTL在呼和浩特被检测到7个(H-Qsy-1~H- Qsy-7), 武川被检测到12个(W-Qsy-1~W-Qsy-12), 其中W-Qsy-6、W-Qsy-7在呼和浩特被同时检测到(H-Qsy-6和H-Qsy-7), 增加目标性状的等位基因均来自供体亲本K58。第三类QTL在呼和浩特被检测到15个(H-Qsy-8~H-Qsy-22), 武川被检测到10个(W-Qsy-13~W-Qsy-22), 除H-Qsy-11、H-Qsy-12、W-Qsy-14和W-Qsy-12由K55提供等位基因外, 其余增加目标性状的等位基因均来自供体亲本K58。
检测到影响结实率的QTL 28个: 两点均未检测到第一类QTL。第二类QTL仅在呼和浩特被检测到1个(H-Qssr-1), 增加目标性状的等位基因来自供体亲本K58。第三类QTL在呼和浩特被检测到5个(H-Qssr-2~H-Qssr-6), 均由K55提供等位基因; 在武川被检测到22个(W-Qssr-1~W-Qssr-22), 其中W-Qssr-8~ W-Qssr-13共6个QTL增加目标性状的等位基因来自供体亲本K58, 其余QTL增加目标性状的等位基因均来自轮回亲本K55。
检测到影响百粒重的QTL 30个: 第一类QTL仅在武川被检测到4个(W-Qhsw-18~21), 增加目标性状的等位基因均来自轮回亲本K55。第二类QTL仅在呼和浩特被检测到1个(H-Qhsw-1), 增加目标性状的等位基因来自供体亲本K58。第三类QTL在呼和浩特被检测到8个(H-Qhsw-2~H-Qhsw-9), 除H-Qhsw-8由K55提供等位基因外, 其余7个QTL增加目标性状的等位基因均来自供体亲本K58; 在武川被检测到17个(W-Qhsw-1~W-Qhsw-17), 共有5个QTL (W-Qhsw-3、W-Qhsw-14~W-Qhsw-17)增加目标性状的等位基因来自供体亲本K58, 其余QTL增加目标性状的等位基因均由轮回亲本K55提供。
检测到影响单株实粒数的QTL 17个, 第一类QTL在呼和浩特被检测到3个(H-Qfsn-9、H-Qfsn-10、H-Qfsn-11), 而且这3个QTL在武川干旱条件下被检测到(W-Qfsn-9、W-Qfsn-10、W-Qfsn-11)。第二类QTL在呼和浩特被检测到13个(H-Qfsn-1~H-Qfsn- 8、H-Qfsn-13~H-Qfsn-17), 在武川被检测到11个(W-Qfsn-1~W-Qfsn-11), 其中W-Qfsn-1~7在呼和浩特被同时检测到(H-Qfsn-1~7)。第三类QTL在呼和浩特被检测到1个(H-Qfsn-12), 其在武川正常供水条件下被同时检测到(W-Qfsn-12), 两点、两种水分条件下检测到的单株实粒数QTL增加目标性状的等位基因均来自供体亲本K58。
检测到影响盘径的QTL 35个, 两点均未检测到第一类QTL。第二类QTL在呼和浩特被检测到8个(H-Qds-1~H-Qds-8), 武川被检测到4个(W-Qds-1~W-Qds-4), 增加目标性状的等位基因均来自轮回亲本K55。第三类QTL在呼和浩特被检测到9个(H-Qds-9~H-Qds-17), 增加目标性状的等位基因均来自供体亲本K58; 在武川被检测到14个(W-Qds-5~W-Qds-18), 其中W-Qds-5、W-Qds-6、W-Qds-15~W-Qds-18由K55提供等位基因, 其余QTL增加目标性状的等位基因来自供体亲本K58。
方差分析检测到“ 一因多效” 位点14个, ORS883-1、M26331、M65672和M48345处同时检测到影响单株产量和百粒重的QTL; M40130、M45907、M45908、M45909、M45910、M159248、M159250、M53398、M53399、M53340处同时定位到影响单株产量和单株实粒数的QTL。
方差分析检测到的QTL中, ORS883-1、M70648、M38509、ORS525-1、M67939、M67940、M91206、M24719、M158109、ORS710-2、M48359、M35489、M73285、M108409共14个位点与卡方检验位点一致, 这些可能是控制向日葵抗旱性的关键QTL。
多数抗(耐)旱QTL定位分析认为, 水、旱环境下表现相似的QTL可能对抗旱性有直接贡献, 而受干旱诱导的QTL可能与耐旱适应性反应有关, 未必对耐旱性有实质性贡献[3, 22-23]。本研究中检测到的QTL受干旱胁迫表达水平不同, 方差分析检测到的154个QTL中, 102个在单一试验点的正常供水条件下被检测到, 占比66.23%; 57个在单一试验点的干旱胁迫条件下被检测到, 占比37.01%, 其中同一水分条件下2个试验点重复检测到影响单株产量、单株实粒数的QTL共10个, 占比6.49%, 这些QTL受环境诱导在不同点稳定表达, 其与抗旱性关系有待研究。同一试验点两种水分条件下检测到影响单株产量、百粒重及单株实粒数的9个QTL, 占比5.84%, 这些QTL可能对向日葵抗旱性有直接贡献, 其中影响实粒数的3个QTL在两点、多种水分条件下均被检测到, 且加性效应方向一致, 可靠性较高, 可能是向日葵抗旱的重要QTL, 在未来的工作中可以进一步验证, 对向日葵抗旱性分子育种研究具有重要意义。
本文利用方差分析和卡方检验两种方法对向日葵定向选择群体进行QTL定位。经干旱胁迫, 通过单株产量筛选获得了明显优于轮回亲本的抗旱回交选择导入系。 选择群体经连续定向选择, 理论上应保留有大部分的耐旱相关基因, 与抗(耐)旱性有关的等位基因导入频率偏离严重, 基于遗传搭车原理的卡方检验使抗旱相关位点的定位得以实现, 方差分析则能够直接定位与性状表型数据对应的位点, 两者结合可提高定位结果的可靠性[16]。本试验用卡方检验检测到274个极显著偏分离位点, 其中有14个与方差分析检测到的QTL一致, 这些位点是向日葵抗旱性相关的关键位点。两种方法检测到的一致性位点较少, 与郑天清等人的研究结果类似, 一些在方差分析中较稳定表达的QTL在导入位点上未表现为等位基因位点的显著偏分离, 而一些极显著偏分离位点则未在方差分析中定位到相关性状的QTL, 其研究表明这些定位到的位点无法简单地以表型选择或改变群体的基因频率来加以利用[24]。张金巍的研究也发现一些在单向方差分析中检测到的解释表型贡献率较大的位点并未在卡方测验法中被检测到, 其推测可能是由于选择的力度抵消了位点原本较高的效应[18]。
本试验的研究结果表明, 利用高代回交结合抗旱筛选得到的选择群体进行向日葵抗旱QTL的发掘定位是可行且有效的。尽可能多地鉴定出影响目标性状的供体导入片段是采用导入系定位QTL的目的与前提, 采用更饱和的分子标记可以防止小的供体导入片段被漏检, 从而鉴定出尽可能多的供体导入片段[25]。SNP标记因其具有高通量、遗传稳定性好、密度高等优点, 在QTL研究中应用广泛。本试验首次将SNP标记结合SSR标记对选择群体基因组进行扫描, 比仅用SSR标记扫描得到了更多的位点(2611个), 在此基础上进行QTL检测, 卡方检验得到274个偏分离位点, 占总位点数的10.49%; 方差分析每个性状在两点、两种水分条件下检测到的QTL数目为17~44个, 平均为30.8个; 每个性状在单个试验点、单种水分条件下单独统计检测到的QTL数目为0~22个, 平均为8.85个。与以往利用SSR标记检测QTL相比, 本试验检测到了更多的QTL, 提高了QTL检测的效率, 未来定位到图谱上则体现为区间更小, 定位更加精准, 同时在目标QTL区域进一步开发SNP标记, 可实现QTL的精细定位。
利用45个选择导入系方差分析检测到154个QTL, 其中2种水分条件下稳定表达的9个, 包括武川影响百粒重的4个(W-Qhsw-18、W-Qhsw-19、W-Qhsw-20、W-Qhsw21)、呼和浩特影响单株产量的2个(H-Qsy-23和H-Qsy-24)及影响单株实粒数的3个(H-Qfsn-9、H-Qfsn-10、H-Qfsn-11), 这些QTL可能对抗旱性有直接贡献。卡方检验检测到极显著偏分离位点274个, 其中14个与方差分析的结果一致, 可能是与抗旱性相关的关键位点。
The authors have declared that no competing interests exist.
作者已声明无竞争性利益关系。
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