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亚麻生氰糖苷合成关键酶CYP79基因家族的鉴定及表达分析
齐燕妮, 李闻娟, 赵丽蓉, 李雯, 王利民, 谢亚萍, 赵玮, 党照, 张建平
作物学报    2023, 49 (3): 687-702.   DOI: 10.3724/SP.J.1006.2023.24042
摘要   (364 HTML18 PDF(pc) (1530KB)(284)  

CYP79蛋白是生氰糖苷合成关键酶, 但关于亚麻CYP79基因的研究鲜有报道。本研究对包括亚麻在内的9种作物的CYP79基因家族进行了鉴定, 并分析了亚麻CYP79基因的序列特征、复制事件、共线性关系、系统进化、顺式作用元件及表达模式。结果表明, 在亚麻、白亚麻、毛果杨、木薯、芝麻、高粱、大豆、葡萄及水稻中分别鉴定到9、9、3、2、5、7、6、16和4个CYP79家族成员; 系统进化分析显示, CYP79基因的进化具有物种特异性; LuCYP79不均匀分布在4条染色体上, 具有1~3个外显子, 其启动子区含大量激素与逆境响应相关元件; 共克隆到8个亚麻CYP79基因的全长DNA序列及5个成员的全长cDNA序列; LuCYP79蛋白序列长度为282~565 aa, 等电点为5.84~9.14, 分子量为31.56~62.86 kD, 均为亲水性蛋白, 定位于内质网; 共有5对基因发生复制事件, 占全部基因的77.8%, 全部经历了强烈的纯化选择, 其中LuCYP79-1LuCYP79-9在拟南芥和木薯中均具有同源基因。表达分析表明, LuCYP79家族成员具有组织特异性, 且各成员在不同遗传背景下表达模式不同, 其中LuCYP79-1LuCYP79-7LuCYP79-8LuCYP79-9在4个品种中的表达差异显著。相关分析表明, 50 d时的LuCYP79-1/LuCYP79-7与成熟亚麻籽中生氰糖苷含量呈极显著正相关, 20 d时的LuCYP79-7/LuCYP79-8及(LuCYP79-7+LuCYP79-9)/LuCYP79-8分别与成熟亚麻籽中生氰糖苷含量呈极显著正相关, 初步推测其可能是亚麻籽生氰糖苷合成的关键基因。研究结果对进一步阐明亚麻CYP79蛋白的功能具有积极意义, 并为培育低生氰糖苷亚麻品种提供了理论参考。


顺式元件Cis-element 典型序列
Typical sequence
特性
Characteristic
基因
Gene name
ARE AAACCA 厌氧诱导必需的顺式作用元件
Cis-acting regulatory element essential for the anaerobic induction
LuCYP79-1, LuCYP79-2, LuCYP79-3, LuCYP79-4, LuCYP79-5, LuCYP79-6, LuCYP79-7, LuCYP79-8, LuCYP79-9
G-box CACGTG/TACGTG 光响应顺式作用元件
Cis-acting regulatory element involved in light responsiveness
LuCYP79-1, LuCYP79-2, LuCYP79-3, LuCYP79-4, LuCYP79-5, LuCYP79-6, LuCYP79-7, LuCYP79-8, LuCYP79-9
GT1-motif GGTTAAT/GGTTAA 光响应元件
Light responsive element
LuCYP79-1, LuCYP79-2, LuCYP79-3, LuCYP79-4, LuCYP79-5, LuCYP79-6, LuCYP79-7, LuCYP79-9
Box 4 ATTAAT 光响应保守模块的一部分
Part of a conserved DNA module involved in light responsiveness
LuCYP79-1, LuCYP79-2, LuCYP79-3, LuCYP79-5, LuCYP79-6, LuCYP79-7, LuCYP79-8, LuCYP79-9
GATA-motif GATAGGG 光响应元件的一部分
Part of a light responsive element
LuCYP79-1, LuCYP79-3, LuCYP79-5, LuCYP79-7, LuCYP79-8, LuCYP79-9
ABRE CGTACGTGCA/
CGCACGTGTC
脱落酸响应顺式元件
Cis-acting element involved in the abscisic acid responsiveness
LuCYP79-1, LuCYP79-2, LuCYP79-3, LuCYP79-4, LuCYP79-5, LuCYP79-6, LuCYP79-7, LuCYP79-8, LuCYP79-9
TGACG-motif TGACG MeJA响应顺式作用元件
Cis-acting regulatory element involved in the MeJA-responsiveness
LuCYP79-1, LuCYP79-2, LuCYP79-3, LuCYP79-4, LuCYP79-5, LuCYP79-6, LuCYP79-7, LuCYP79-8
CGTCA-motif CGTCA MeJA响应顺式作用元件
Cis-acting regulatory element involved in the MeJA-responsiveness
LuCYP79-1, LuCYP79-2, LuCYP79-3, LuCYP79-4, LuCYP79-5, LuCYP79-6, LuCYP79-7, LuCYP79-8
TGA-element AACGAC 生长素响应元件
Auxin-responsive element
LuCYP79-1, LuCYP79-2, LuCYP79-5, LuCYP79-8
AuxRR-core GGTCCAT 生长素响应顺式作用元件
Cis-acting regulatory element involved in auxin responsiveness
LuCYP79-4, LuCYP79-5
AuxRE TGTCTCAATAAG 生长素响应元件的一部分
Part of an auxin-responsive element
LuCYP79-7
GARE-motif TCTGTTG 赤霉素响应元件
Gibberellin-responsive element
LuCYP79-2, LuCYP79-9
P-box CCTTTTG 赤霉素响应元件
Gibberellin-responsive element
LuCYP79-2
顺式元件Cis-element 典型序列
Typical sequence
特性
Characteristic
基因
Gene name
LTR CCGAAA 低温响应顺式作用元件
Cis-acting element involved in low-temperature responsiveness
LuCYP79-1, LuCYP79-2, LuCYP79-4, LuCYP79-6, LuCYP79-7
MBS CAACTG 参与干旱诱导的MYB结合位点
MYB binding site involved in drought-inducibility
LuCYP79-1, LuCYP79-2, LuCYP79-8, LuCYP79-9
TC-rich repeats GTTTTCTTAC 参与防御和胁迫响应的顺式作用元件
Cis-acting element involved in defense and stress responsiveness
LuCYP79-2
RY-element CATGCATG 参与种子特异性调控的顺式调控元件
Cis-acting regulatory element involved in seed-specific regulation
LuCYP79-4, LuCYP79-5, LuCYP79-7
CAT-box GCCACT 分生组织相关的顺式调控元件
Cis-acting regulatory element related to
meristem expression
LuCYP79-5, LuCYP79-6, LuCYP79-7
A-box CCGTCC 顺式调控元件
Cis-acting regulatory element
LuCYP79-3, LuCYP79-7
GC-motif CCCCCG 参与缺氧特异性诱导的类增强子元件
Enhancer-like element involved in anoxic specific inducibility
LuCYP79-1, LuCYP79-7
O2-site GATGA(C/T)(A/G)TG (A/G)/GATGATGTGG 参与玉米醇溶蛋白新陈代谢调节的顺式调控元件
Cis-acting regulatory element involved in zein metabolism regulation
LuCYP79-1, LuCYP79-2, LuCYP79-6
MBSI TTTTTACGGTTA 参与黄酮类合成基因调控的MYB结合位点
MYB binding site involved in flavonoid biosynthetic genes regulation
LuCYP79-3
HD-Zip 1 CAAT(A/T)ATTG 参与栅栏叶肉细胞分化的元件
Element involved in differentiation of the palisade mesophyll cells
LuCYP79-1
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表3 LuCYP79启动子顺式作用元件
正文中引用本图/表的段落
通过Blastp比对, CDD和Pfam数据库进行结构域分析以及CYP79家族保守位点的确认, 在亚麻、野生白亚麻、毛果杨、木薯、芝麻、高粱、大豆、葡萄及水稻基因组中分别鉴定到9、9、3、2、5、7、6、16和4个CYP79成员(表1和附表3)。栽培亚麻与野生白亚麻CYP79基因数目相同, 但不同物种间CYP79家族成员的数量具有显著差异。根据亚麻CYP79基因在染色体上的位置, 将其依次命名为LuCYP79-1~LuCYP79-9
为进一步研究LuCYP79基因的转录调控机制和潜在功能, 提取起始密码子上游2000 bp预测顺式作用元件。如表3所示, LuCYP79启动子区除含有真核生物基本元件(TATA-box、CAAT-box)外, 均含有厌氧诱导必需的响应元件(ARE)和光响应元件(G-box、GT1-motif、Box 4和GATA-motif等)。LuCYP79启动子区还含有4类激素响应元件, 分别为脱落酸响应元件(ABRE)、茉莉酸甲酯响应作用元件(TGACG-motif和CGTCA-motif)、生长素响应元件(TGA-element、AuxRR-core和AuxRE)和赤霉素响应元件(GARE-motif和P-box)。所有LuCYP79基因启动子区都含有ABRE; 除LuCYP79-9外, 其余8个基因都含有TGACG-motif和CGTCA-motif; 有6个基因含有不同类型的生长素响应元件。LuCYP79启动子还含有与逆境胁迫相关的作用元件, 其中有5个基因含有低温响应元件(LTR), 4个基因含有干旱响应元件(MBS)。此外, LuCYP79启动子还含有种子调控元件(RY-element)、分生组织相关调控元件(CAT-box)和玉米醇溶蛋白代谢相关的调控元件(O2-site)等。
利用qRT-PCR分析9个LuCYP79家族成员在4个亚麻品种不同发育阶段种子中的表达模式发现, 各基因在不同品种中具有不同的表达模式, 如LuCYP79-1LuCYP79-3、LuCYP79-4LuCYP79-9在陇亚10号开花后40 d的种子中表达量最高, 但在R2中的表达量在开花后20 d达到最高, 而在匈牙利3号中, 其在开花后30 d的种子中表达量最高; LuCYP79-2在陇亚10号、张亚2号、R2及匈牙利3号中的表达量分别在开花后50 d、40 d、20 d及30 d的种子中达到最高; LuCYP79-5在4个品种种子中的表达量分别在50 d、40 d、50 d、20 d达到最高; LuCYP79-6在不同品种种子中的表达量高峰分别为10 d、50 d、20 d、20 d; LuCYP79-7的表达量高峰分别在30 d、40 d、20 d、20 d; LuCYP79-8分别在30 d、40 d、20 d、30 d的种子中表达量较高(图7)。总的来说, 各基因在张亚2号不同发育阶段种子中的表达量普遍低于其他3个品种。除表达模式外, 不同发育阶段各基因的累积表达量在不同品种中具有明显差异(图8), 其中LuCYP79-1LuCYP79-7LuCYP79-8LuCYP79-9在4个品种中的差异最明显, 最高表达量是最低表达量的4倍以上, 差异最大的可达到28倍。
本文的其它图/表