引用本文
章洁琼, 李红艳, 胡小南, 单志慧, 唐桂香. 农杆菌介导的RNAiCP基因在大豆中的转化 . 作物学报, 2013, 39(9): 1594-1601[ZHANG Jie-Qiong, LI Hong-Yan, HU Xiao-Nan, SHAN Zhi-Hui, TANG Gui-Xiang. Agrobacterium tumefaciens Mediated Transformation of RNAiCP Gene into Soybean (Glycine max L.) . Acta Agronomica Sinica, 2013, 39(9): 1594-1601]  
Permissions
Copyright©2013, Editorial office of Acta Agronomica Sinica
This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited.
农杆菌介导的RNAiCP基因在大豆中的转化
章洁琼1, 李红艳1, 胡小南1, 单志慧2,*, 唐桂香1,*
1浙江大学农业与生物技术学院, 浙江杭州 310058
2中国农业科学院油料作物研究所, 湖北武汉 430062
* 通讯作者(Corresponding authors): 唐桂香, E-mail:tanggx@zju.edu.cn; 单志慧, E-mail:zhihuijimi@163.com
基金:本研究由国家转基因生物新品种培育科技重大专项(20112X08004-004-009), 国家自然科学基金项目(31071443)和浙江省科技厅公益技术项目(2012C32001)资助。
摘要

花叶病毒(soybean mosaic virus, SMV)病是大豆主要病害之一, 生产上常采用种植抗性品种方法来防治。本研究以RNA干扰花叶病毒衣壳蛋白(coat protein, CP)基因为表达载体,Bar基因作为筛选标记基因, 成熟子叶节为外植体, 采用农杆菌介导法获得了22株T0代转基因大豆生根苗, 经草丁膦涂抹、Bar试纸条和PCR法鉴定, 获得RNAiCP转基因植株18株; 对转基因植株T1代的遗传分析表明, 外源基因能够稳定遗传到下一代且符合孟德尔遗传规律; T1代Southern杂交表明, 导入的干扰片段为单拷贝; 花叶病毒摩擦接种表明, RNAiCP转基因大豆植株具有抗花叶病毒特性; 摩擦接种后3周, DAS-ELISA检测进一步表明, RNAiCP转基因植株花叶病毒检出率仅为7.69%, 而非转基因植株为100%。这表明RNAi花叶病毒CP基因可用于抗大豆花叶病毒的研究。

关键词: 大豆; RNAi CP; 遗传转化; 大豆花叶病毒; 病毒鉴定
Agrobacterium tumefaciens Mediated Transformation of RNAiCP Gene into Soybean (Glycine max L.)
ZHANG Jie-Qiong1, LI Hong-Yan1, HU Xiao-Nan1, SHAN Zhi-Hui2,*, TANG Gui-Xiang1,*
1Institute of Crop Science, College of Agriculture and Biotechnology, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China
2Oil Crops Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Wuhan 430062, China
Abstract

Soybean mosaic virus (SMV) causes a severe disease in soybean, which can be efficiently prevented by planting resistant cultivars. In order to improve the SMV resistance of soybean, anagrobacterium-tumefaciensmediated gene transformation was conducted in this study by using RNAi soybean mosaic virus coat protein (CP) gene as the expression vector,bargene as the selective marker gene, and cotyledonary-node as the explant to get RNAi transformation soybean. As results, 22 putative transgenic soybean plants were obtained and 18 positive transgenic soybean plants were identified by coating with leaves herbicide, using bar protein quick dip stick and PCR analysis. The segregation ratio of T1 transgenic progeny showed that the transformed gene could be inherited according to the Mendel's law. The T1 southern blot analysis showed that the imported interference fragment was one copy. After SMV friction inoculation, the RNAiCPtransgenic soybean plants showed good resistance to SMV. DAS-ELISA analysis at three weeks after SMV inoculation revealed that 100% of the non-transgenic lines SMV while only 7.69% of the RNAi plants were infected by SMV. The results demonstrated that the RNAiCPtransgenic soybean plants obtained in the study are valuable resources for improving the SMV resistance of soybean.

Keyword: Soybean; RNAi CP; Genetic transformation; Soybean mosaic virus; Virus identification

大豆花叶病毒( Soybean mosaic virus, SMV)病是世界范围内普遍发生的病毒病害之一, 1915年美国首次报道了该病害。1921年Gardner和Kendrick[1]将病原描述为SMV。在病毒分类学上, 大豆花叶病毒属马铃薯Y病毒属( Potyvirus)成员, 主要通过种子带毒、蚜虫以非持久性方式以及汁液等方式传播。大豆花叶病毒病不仅引起大豆植株矮化、叶片皱缩、花叶、顶枯等症状, 而且造成大豆种粒斑驳, 降低大豆外观品质, 病田一般减产10%~30%[2], 严重时大面积绝产, 给大豆生产造成巨大的经济损失。因此, 大豆花叶病毒引起了国内外科研人员的高度重视并对其开展了广泛的研究[3,4,5]。

培育和种植抗病品种是防治大豆花叶病毒病最经济有效的方法, 但采用回交及杂交系谱法培育抗SMV大豆品种需要一个长期的过程。近年来, 随着RNA干扰(RNAi)——一种抵消转录后调节的内源性技术的发展, 利用RNAi技术创制抗病毒转基因植株已成为可能[6,7]。Smith等[8]和Kalantidis等[9]采用RNAi方法分别获得烟草和黄瓜抗花叶病毒植株; Missiou 等[10]通过干扰马铃薯PVY病毒3端高度保守区域片段的方法也获得了抗PVYN、PVYO和PVYNTN病毒植株。本研究拟利用大豆花叶病毒CP基因高度保守片段构建反向重复的RNAi载体为表达载体, 以 Bar基因作为筛选标记基因, 通过农杆菌介导大豆子叶节法, 获得RNAi抗花叶病毒转基因大豆, 期望获得免疫或高抗SMV的转基因大豆, 为防治大豆花叶病毒提供新种质, 加快大豆抗病毒育种进程。

1 材料与方法
1.1 试验材料

大豆转化受体为中国农业科学院油料作物研究所育成品种天隆1号; RNAi表达载体pb7gwiwg2- CP616 (图1)从比利时根特大学生物技术研究中心购买, 由中国农业科学院油料作物研究所构建[11]; pb7gwiwg2-CP616载体含有来源于武汉大豆花叶病毒的G7株系(AY216010) CP基因的616 bp保守片段及膦丝菌素乙酰转移酶基因( Bar); 所用的农杆菌菌株为EHA105; 大豆花叶病毒带毒种子(G7株系)由上海交通大学曹趆平教授惠赠。

图1 pb7gwiwg2-CP616重组表达载体Fig. 1 Recombination expression vector of pb7gwiwg2-CP616

1.2 农杆菌介导大豆子叶节转化体系

参照Zhang等[12]和Paz等[13]描述的方法, 加以改进, 利用本实验室前期建立的农杆菌介导大豆子叶节转化体系介导转化大豆。选择成熟、健康、饱满的大豆种子经氯气灭菌后, 在通风柜中过夜吹去多余的氯气; 播种在发芽培养基(germination medium, GM)中发芽1 d; 然后分离大豆子叶节为外植体, 经OD650值为0.8左右的农杆菌菌液侵染30 min, 在共培养基(co-cultivation medium, CCM)光照培养3 d; 之后在芽诱导培养基(shoot induction medium, SI)中诱导培养4周, 每2周更换新鲜的培养基; 将外植体转入芽伸长培养基(shoot elongation medium, SE)上诱导芽的再生; 芽伸长后再转入生根培养基(rooting medium, RM)中诱导生根; 生根后先在培养室中驯化10 d, 待苗成活后移入温室中生长, 约80 d获得转基因生根苗。大豆转化过程所用培养基配方见表1。

表1 农杆菌介导大豆子叶节转化法培养基配方Table 1 Media composition of soybean cotyledonary-node Agrobacterium-mediated transformation
1.3 转基因植株的鉴定

1.3.1 除草剂抗性鉴定 将商用草丁膦原液稀释为135 mg L-1, 以主叶脉为分界线用棉签蘸该液擦拭半片叶子, 标记未涂的半片叶子, 温室中培养1周后观察叶片对除草剂的反应。

1.3.2 Bar试纸条检测 取约半个指甲大小叶片放入1.5 mL离心管中, 用研磨棒将叶片研碎, 加入0.3 mL提取液, 搅拌均匀, 将购自Envirologix公司的Quickstix Kit for Liberty Link (bar) Cotton Leaf & Seed快速检测Bar蛋白质的试纸条按标识的方向插入混合液中, 5 min后观察结果。试纸条出现2条带为阳性植株, 出现1条带为阴性植株, 没有条带出现表明操作有误。

1.3.3 PCR鉴定法 根据Edward等[14]介绍的方法快速提取大豆基因组DNA用于PCR检测。采用20 μL的PCR反应体系, 引物由TaKaRa公司合成。 Bar基因引物F序列为5-CAGCTGCCAGAAACCC ACGT-3, R为5-CTGCACCATCGTCAACCACT-3, 目的扩增片段为436 bp, 扩增条件为94℃ 5 min; 94℃ 30 s, 58℃ 30 s, 72℃ 20 s, 30个循环, 72℃ 10 min; CP基因引物F为5-TTTGCTGAACTTGGTCT CCA-3; R为5-TGATCTTCCCTTCAACCATT-3, 目的扩增片段为616 bp, 扩增条件为94℃ 5 min; 94℃ 30 s, 54℃ 45 s, 72℃ 1 min, 30个循环, 72℃ 10 min。以1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。

1.4 RNAi CP转基因大豆T1代遗传分析

对T1代转基因大豆分别进行除草剂涂抺和Bar试纸条鉴定, 分析T1代转基因大豆的分离比例, 采用SPSS11.0软件对各株系进行卡方测验。

1.5 转基因植株的Southern blot鉴定

参照改良的CTAB法提取转基因植株叶片的DNA[15], 用 EcoR I消化转基因大豆基因组DNA, 电泳后转膜, 按照Roche公司的DIG High Primer Labeling and Detection Starter Kit II说明书固定、标记、杂交和检测。

1.6 转基因大豆T1代植株花叶病毒摩擦接种抗性鉴定

播种带毒(大豆花叶病毒G7株系)的大豆种子, 取新鲜三叶期病叶, 用0.01 mol L-1, pH 7.0的磷酸缓冲液研磨病叶, 1 g叶片需用10 mL缓冲液。接种液中放入少量的600目金刚沙, 于单叶期将2片单叶用浸过接种液的棉棒摩擦接种, 之后用水冲洗, 接种后3周观察大豆花叶病毒症状, 植株生长环境温度需保持在20~30℃[16]。

1.7 大豆花叶病毒的DAS-ELISA检测

大豆花叶病毒摩擦接种后3周参照ACD公司的DAS-ELISA 试剂盒说明书进行DAS-ELISA检测, 测定各株系叶片405 nm的OD值(P)及阴性对照OD值(N), 以其比值P/N>2视为感花叶病毒。

2 结果与分析
2.1 农杆菌介导法获得RNAi CP转基因大豆植株

室在前期大豆农杆菌介导转化体系优化基础上, 从国内外25个基因型中筛选到适宜转化的受体天隆1号。以天隆1号为受体, 采用农杆菌介导大豆子叶节转化体系, 分别自命名为SMV-1、SMV-2和SMV-3的3批次试验(表2)中转化了186、91、105个外植体, 分别获得7、6和9株T0代RNAi CP转基因大豆生根苗。

分别采用草丁膦涂抹法、BAR试纸条法、PCR法鉴定22株T0代转基因大豆生根苗。由图2可知, 叶片经135 mg L-1草丁瞵涂抹半片叶后, 22株T0代植株中, 4号、11号、12号、14号植株表现涂草丁膦的左半张叶片变黄而呈现枯萎状, 而未涂草丁膦的右半张叶片仍保持绿色状; 剩下的18株T0代植株表现涂与不涂草丁膦的两个半叶没有明显差异, 说明草丁膦选择标记基因 Bar已被转入这18株大豆植株中, 叶片表现草丁膦抗性。

Bar试纸条结果如图3所示, T0代转基因大豆植株4号、11号、12号、14号株系的测试线(test line)不显现红色, 表明这几个株系中不含有筛选标记基因表达的Bar蛋白, 为阴性植株; 剩下的18株T0代转基因植株的对照线和测试线均显现红色, 表明均为阳性植株。

图2 T0代转基因大豆植株草丁膦涂抹鉴定结果图CK: 不含重组质粒转化得到的大豆植株叶片; 1~22表示T0代转基因大豆植株叶片。Fig. 2 Detection of T0 putative transgenic soybean plants by coating half leaves with herbicideCK: negative control; 1-22: T0 putative transgenic soybean plants.

图3 T0代转基因大豆植株bar试纸条鉴定结果图1~22表示T0代转基因大豆植株叶片。Fig. 3 Detection of T0 putative transgenic soybean plants by bar protein quick dip stick1-22: T0 putative transgenic soybean plants.

T0代转基因植株 Bar基因(图4-A)和干扰片段 CP基因(图4-B)的PCR产物电泳结果图均一致表明, 编号为4号、11号、12号和14号的T0代转基因株系没有扩增出目的片段, 为阴性植株, 剩余的18株T0代株系均有436 bp的 Bar基因目的片段和616 bp的 CP基因目的扩增片段, 为阳性转基因植株。

3种检测结果一致表明, SMV-1、SMV-2和SMV-3批次试验中分别获得了6株、5株和7株阳性转化植株, 即共获得18株T0代RNAi CP基因阳性转化植株。SMV-1、SMV-2和SMV-3批次的转化效率分别为3.22%、5.49%和6.67%, 平均转化效率为5.13% (表2)。

图4 T0代转基因大豆植株PCR鉴定结果图A: Bar基因; B: CP基因; M: Marker DL2000; +: pb7gwiwg2-CP616质粒DNA; -: 不含重组质粒转化得到的大豆植株叶片DNA;1~22: T0代转基因大豆植株叶片。Fig. 4 Detection of T0 putative transgenic soybean plants by PCRA: Bargene; B: CPgene; M: marker DL2000; +: positive control; -: negative control; 1-22: T0 putative transgenic soybean plants.

表2 大豆农杆菌介导转化RNAi CP基因效率Table 2 Agrobacterium- tumefaciensmediated transformation efficiency of RNAi CP gene in soybean
2.2 转基因植株Southern blot鉴定结果

以质粒pb7gwiwg2-CP616为模板, CP -F和CP -R为引物PCR扩增出约616 bp的 CP基因片段, 经琼脂糖电泳回收目的片段, 采用随机引物法标记 CP探针。随机选取6株PCR结果为阳性的T1代RNAi CP转基因大豆植株, pb7gwiwg2-CP616质粒DNA为正对照, 以非转基因大豆植株基因组DNA为负对照, 进行Southern杂交分析, 图5表明, CP干扰片段均已转入转基因大豆植株的基因组DNA中, 且均为单拷贝, 说明 CP干扰片段可在转基因大豆植株后代中稳定遗传。

图5 T1代转基因植株Southern blot结果图-: 不含重组质粒转化得到的大豆植株; +: pb7gwiwg2-CP616质粒DNA; 2-11、2-15、2-26、2-30、2-32、3-5为T1代阳性转基因植株。Fig. 5 Southern blot analysis of positive T1 generation transgenic soybean-: negative control; +: positive control; 2-11, 2-15, 2-26, 2-30, 2-32, and 3-5: transformed plants of T1 generation soybean.

2.2 RNAi CP转基因大豆遗传分析

18株T0代RNAi CP转基因大豆株系在温室条件下生长, 经自花授粉后, 收获T1代种子。其中18号的T0代株系表现不育性, 不能结实, 最终共获得17个T0代RNAi CP转基因大豆株系的种子, 这些T0代转基因大豆株系的种子数最少的为1粒, 最多的为35粒(表3); 播种各T0代转基因大豆株系的这些种子, 发芽生长以获得T1代植株, 其中T0代编号为5号和10号的株系均只收获了1粒种子, 且这2 个株系的种子播种后均不能正常发芽, 无法获得T1代植株; 剩余的15个T0代株系的种子播种后均可正常发芽。由表3可知, 15个T0代RNAi CP转基因大豆株系中, 5个(编号为7号、8号、15号、19号、20号)在T1代表现沉默, 转入的目标片段不能遗传到下一代; 剩余的10个(编号为1号、2号、3号、6号、9号、13号、16号、17号、21号、22号)转入的基因片段能在T1代遗传, RNAi CP转基因大豆T1代的遗传率为66.67%。稳定遗传的10个株系中, 有4个(编号为6号、9号、21号、22号)在后代没有分离, 这可能与这几个后代本身结种子的粒数较少有关; 剩余6个后代均分离, 卡方测验表明除17号外, 1号、2号、3号、13号、16号T0代转基因株系在T1代的分离均符合孟德尔1对基因遗传规律。

表3 T1代转基因大豆后代的分离Table 3 Segregation ratio of T1 transgenic RNAi CPsoybean plant
2.3 RNAi CP转基因大豆花叶病毒抗性鉴定

接种花叶病毒后, 非转基因大豆植株出现了花叶、叶脉褐化, 叶片皱缩等症状(图6-A), 大部分T1代RNAi CP转基因植株叶片仍保持鲜绿状, 小部分植株的叶片出现了轻微的花叶症状, 但无皱缩症状出现(图6-B), 与对照材料相比, 各转化材料SMV抗病性显著提高, 这表明RNAi CP转基因植株对大豆花叶病毒产生了一定的耐受性, 可对SMV免疫或延迟发病。

图6 SMV接种后植株抗病性比较A: 非转基因植株叶片; B: T2代转基因植株叶片。Fig. 6 Comparison of SMV resistanceA: leaves of non-transgenic soybean plant; B: leaves of transgenic soybean T2plant.

进一步的DAS-ELISA检测结果表明(表4), 转基因大豆植株OD405值明显低于非转基因植株, 将反应孔OD值(P)与阴性对照孔OD值(N)比值(P/N)>2作为感花叶病毒植株的判断标准, 结果显示非转基因大豆植株P/N值均大于2, SMV检出率为100%; 而T1代转基因植株中, 只有1个样品P/N值大于2, SMV检出率仅为7.69%, 表明RNAi CP转基因大豆植株对花叶病毒产生了抗性。

表4 以DAS-ELISA检测大豆非转基因和RNAiCP植株的花叶病抗性Table 4 Detection of soybean mosaic virus in both non-transgenic and RNAi CP plants by DAS-ELISA
3 讨论

研究表明, 大豆花叶病毒在自然条件下有变异性, 抗病资源的抗性具有明显的株系特异性, 寄主的抗性因病毒株系的变异而丧失, 因此, 迫切需要培育广谱、抗性持久的大豆抗花叶病毒病品种[11]。RNAi技术利用病毒本身的基因导入植物, 从而获得抗病毒植株, 为抗病毒育种提供了新的策略和方法, 具有高度的可行性, 人们将水稻黄斑病毒( Rice yellow mottle virus, RYMV)复制所必需的某种酶基因导入水稻, 通过诱导RNA干扰, 已培育出具有RYMV抗性的水稻, 并已稳定遗传3代[17]。Abbott等[18]以大麦黄矮病毒PAV株系(Barley yellow dwarf viruses-PAV, BYDV-PAV)的多聚酶基因反向重复序列载体转化大麦, 获得PAV免疫植株, 以ELISA检测和田间接种均未检测到病毒。转病毒外壳蛋白 CP基因是研究最早、应用最广泛的抗病毒手段, Hayakawa等[19]和燕义唐等[20]将条纹叶枯病毒( Rice stripe virus, RSV)的 CP基因分别导入粳稻和籼稻中, 发现表达 CP基因的转基因水稻植株对RSV的侵 染具一定抗性。朱俊华等[21]用马铃薯坏死病毒衣壳蛋白基因片段构建反向重复载体, 获得的抗病植株比例大大高于用正向重复载体转化获得的抗病植株比例。

在本研究中, 我们利用大豆花叶病毒 CP基因的高度保守片段构建成反向重复的RNAi植物表达载体, 选择 CP基因高度保守片段, 能避免病毒因非保守区的高突变率而产生的抗性突变株; 另外, 获得的转基因植株不含抗生素基因, 以除草剂 bar基因作为选择标记基因, 生物安全性高, 后期可采用草丁膦喷施法对大田中的转基因植株进行大规模的筛选, 操作简单且成本低, 极大方便了转基因植株的后续鉴定及育种工作。本研究获得的转基因材料经大豆花叶病毒接种鉴定表明, 转基因植株对大豆花叶病毒具有一定抗性, 但不同转化材料对大豆花叶病毒的耐受性表现不同。今后需进一步研究这些转化材料后代对不同大豆花叶病毒株系以及与SMV同源性较高的其他病毒的抗性表现, 从而选择出具有病毒广谱抗性的大豆新种质。

基于RNA干扰原理获得的转基因植株的抗病性可遗传到后代, 但会在后代中出现分离现象, 该现象很复杂, 可能与转基因的拷贝数及整合方式有关[22]。本研究表明, 部分T0代RNAi CP转化株系在T1代沉默, 转化片段不能遗传到后代; 部分T0代株系在T1代的分离比符合孟德尔1对显性基因遗传规律, 据此可知转化片段在T1代已稳定遗传, 但其遗传稳定性有待进一步研究。

4 结论

采用农杆菌介导的大豆转化体系, 将反向重复的 CP基因导入大豆基因组, 获得了RNAi CP转基因植株, 接种鉴定表明具抗大豆花叶病毒的特性, 为培育抗SMV大豆新种质、丰富抗病遗传材料奠定了基础。

A
参考文献
[1] Gardner M W, Kendrick J B. Soybean mosaic virus. Agric Res , 1921, 22: 123-124 [本文引用:1]
[2] Wang L-Z(王连铮), Wang J-L(王金陵). Genetics and Breeding in Soybean (大豆遗传育种学) . Beijing: Science Press, 1992. pp208-304(in Chinese) [本文引用:1]
[3] Wang D-G(王大刚), Ma Y(马莹), Liu N(刘宁), Zheng G-J(郑桂杰), Yang Z-L(杨中路), Yang Y-Q(杨永庆), Zhi H-J(智海剑). Inheritance of resistances to Soybean mosaic virus strains SC4 and SC8 in soybean. Acta Agron Sin (作物学报), 2012, 38(2): 202-209 (in Chinese with English abstract) [本文引用:1] [CJCR: 1.8267]
[4] Lindbo J A, Dougherty W G. Plant pathology and RNAi: a brief history. Annu Rev Phytopathol , 2005, 43: 191-204 [本文引用:1]
[5] Kamachi S, Mochizuki A, Nishiguchi M, Tabei Y. Transgenic Nicotiana benthamiana plants resistant to cucumber Green mottle mosaic virus based on RNA silencing. Plant Cell Rep , 2007, 26: 1283-1288 [本文引用:1] [JCR: 2.274]
[6] Bass B L. Double-strand ed RNA as a template for gene silencing. Cell , 2000, 101: 235-238 [本文引用:1]
[7] Sharp P A. RNA interference. Genes Dev , 2001, 15: 485-490 [本文引用:1]
[8] Smith N A, Singh S P, Wang M B, Stoutjesdijk P A, Green A G, Waterhouse P M. Total silencing by intron-spliced hairpin RNAs. Nature , 2000, 407: 319-320 [本文引用:1]
[9] Kalantidis K, Psaradakis S, Tabler M, Tsagris M. The occurrence of CMV-specific short RNAs in transgenic tobacco expressing virus-derived double-strand ed RNA is indicative of resistance to the virus. Mol Plant Microbe Interact , 2002, 15: 826-833 [本文引用:1]
[10] Missiou A, Kalantidis K, Boutla A, Tzortzakaki S, Tabler M, Tsagris M. Generation of transgenic potato plants highly resistant to Potato virus Y (PVY) through RNA silencing. Mol Breed , 2004, 14: 185-197 [本文引用:1] [JCR: 2.852]
[11] Xu Z-H(许宗宏), Hao Q-N(郝青南), Chen L-M(陈李淼), Sun D-C(孙佃臣), Tian X-X(田星星), Shan Z-H(单志慧). Plant expression construct based on RNAi for Soybean mosaic virus. Acta Agric Boreali-Sin (华北农学报), 2010, 25: 1-4 (in Chinese with English abstract) [本文引用:2] [CJCR: 2.0855]
[12] Zhang Z Y, Xing A Q, Staswick P. The use of glufosinate as a selective agent in Agrobacterium-mediated transformation of soybean. Plant Cell Tissue Organ Cult , 1999, 56: 37-46 [本文引用:1]
[13] Paz M M, Martinez J C, Kalvig A B, Fonger T M, Wang K. Improved cotyledonary node method using an alternative explant derived from mature seed for efficient Agrobacterium- mediated soybean transformation. Plant Cell Rep , 2004, 25: 206-213 [本文引用:1]
[14] Edwards K, Johnstone C, Thompson C. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis. Nucl Acids Res , 1991, 19: 1349 [本文引用:1]
[15] Chen K-S(陈昆松), Li F(李方), Xu C-J(徐昌杰), Zhang S-L(张上隆), Fu C-X(傅承新). An efficient Macro-method of genomic DNA isolation from Actinidia chinensis leaves. Hereditas (遗传), 2004, 26(4): 529-531 (in Chinese with English abstract) [本文引用:1] [CJCR: 0.9787]
[16] Liao L, Chen P, Rajcan I, Buss G R, Tolin S A. Genetic analysis of “8101” soybean containing three genes for resistance to Soybean mosaic virus. Crop Sci , 2011, 51: 503-511 [本文引用:1]
[17] Pinto Y M, Kok R A, Band combe D C. Resistance to rice Yellow mottle virus (RYMV) in cultivated African rice varieties containing RYMV transgenes. Nat Biotechnol , 1999, 17: 702-707 [本文引用:1]
[18] Abbott D, Wang M B, Waterhouse P A. A single copy of virusderived transgene encoding hairpin RNA gives immunity to barley yellow dwarf virus. Mol Plant Pathol , 2000, 1: 347-356 [本文引用:1]
[19] Hayakawa T, Zhu Y, Itoh K, Kimura Y, Izawa T, Shimamoto K, Toriyama S. Genetically engineered rice resistant to rice stripe virus, an insect-transmitted virus. Proc Natl Acad Sci USA , 1992, 89: 9865-9869 [本文引用:1]
[20] Yan Y T, Wang J F, Qiu B S, Tian B. Resistance to Rice stripe virus conferred by expression of coat protein in transgenic indica rice plants regenerated from bombarded suspension culture. Virol Sin , 1997, 12: 260-269 [本文引用:1]
[21] Zhu J-H(朱俊华), Zhu X-P(竺晓平), Wen F-J(温孚江), Bai Q-R(白庆荣), Zhu C-X(朱常香), Song Y-Z(宋云枝). The effect of PVY-CP segment length on RNA-mediated virus resistance. Sci China Ser C: Life Sci (中国科学C辑: 生命科学), 2004, 34(1): 23-30 (in Chinese) [本文引用:1]
[22] van den Boogaart T, Wen F J, Davies J W, Lomonossoff G P. Replicase-derived resistance against Pea early browning virus in Nicotiana benthamiana is an unstable resistance based upon posttranscriptional gene silencing. Mol Plant-Microbe Interact , 2001, 14: 196-200 [本文引用:1]