根据种植面积选取东北和黄淮海地区自20世纪40年代以来在生产上大面积种植的大豆品种共89份, 其中东北地区选育的品种64份, 包括黑龙江省40份, 吉林省15份, 辽宁省9份; 黄淮海地区品种25份, 其中北京市3份, 河北省4份, 山东省12份, 河南省5份, 湖北省1份(在黄淮海地区种植) (表1)。

取苗期大豆幼嫩叶片, 参考Doyle和Doyle^[13]的CTAB法提取总DNA, 用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量, 用微量可见分光光度计SMA3000测定DNA浓度, 稀释为工作浓度25 ng µL^-1。

选取已发表的或在SoyBase (http://www.soybase.org/)网站登录的与产量及其构成因子^[14,15,16]、株高和抗倒伏能力等植株形态性状^[17,18,19]以及与植株开花、成熟^[20,21]、品质^[22,23,24]、抗逆性和适应性等性状相关的150个SSR标记来分析所选取大面积种植品种的遗传多样性。SSR标记的引物序列来源于SoyBase大豆数据库, 由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

PCR反应在Mastercycler Gradient PCR仪上进行。20 µL PCR体系, 包含50 ng基因组DNA、1×PCR缓冲液、0.75 U Taq DNA聚合酶、0.2 mmol L^-1 dNTPs、0.15 μmol L^-1引物。PCR 程序为94℃ 5 min; 94℃ 30 s, 47℃ 30 s, 72℃ 30 s, 35个循环; 72℃ 5 min; 4℃保存。PCR扩增产物经6%变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离, 硝酸银染色。

每对SSR引物检测一个位点, 将所得每条多态性带记为1个等位变异, 根据每个SSR标记检测出的等位变异的有无, 分别以0、1记载各品种的SSR等位变异, 在相同迁移率位置上, 有带记为“1”, 无带记为“0”, 缺失记为“9”。 计算每个SSR引物扩增的等位变异的多态性信息含量(PIC),

其中 P_i 为第 i 个等位基因在 k 位点上的群体的比例。用NTSYS2.1软件计算群体种质间Nei和Li遗传相似系数^[23], 根据所得相似系数, 用非加权配对算术平均法(unweighted pair group method using arithmetic average, UPGMA)^[26]绘制树状聚类图, 进行聚类分析。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 供试品种名称、来源及育成年份 Table 1 Variety name, geographic origin, and release year 编号 No. 品种 Variety 来源 Original province 育成年份 Release year 编号 No. 品种 Variety 来源 Original province 育成年份 Release year 1 黑龙江41 黑龙江 1958 46 吉林3号 吉林 1963 Heilongjiang 41 Heilongjiang Jilin 3 Jilin 2 克系283 黑龙江 1956 47 吉林6号 吉林 1963 Kexi 283 Heilongjiang Jilin 6 Jilin 3 黑河3号 黑龙江 1966 48 铁丰3号 辽宁 1967 Heihe 3 Heilongjiang Tiefeng 3 Liaoning 4 丰收10号 黑龙江 1966 49 铁丰18 辽宁 1973 Fengshou 10 Heilongjiang Tiefeng 18 Liaoning 5 黑河51 黑龙江 1967 50 开育3号 辽宁 1976 Heihe 51 Heilongjiang Kaiyu 3 Liaoning 6 丰收12 黑龙江 1969 51 吉林13 吉林 1976 Fengshou 12 Heilongjiang Jilin 13 Jilin 7 丰收17 黑龙江 1977 52 九农9号 吉林 1976 Fengshou 17 Heilongjiang Jiunong 9 Jilin 8 北丰2号 黑龙江 1983 53 开育8号 辽宁 1980 Beifeng 2 Heilongjiang Kaiyu 8 Liaoning 9 丰收19 黑龙江 1985 54 长农4号 吉林 1985 Fengshou 19 Heilongjiang Changnong 4 Jilin 10 黑河9号 黑龙江 1990 55 吉林20 吉林 1985 Heihe 9 Heilongjiang Jilin 20 Jilin 11 北丰9号 黑龙江 1995 56 铁丰24 辽宁 1988 Beifeng 9 Heilongjiang Tiefeng 24 Liaoning 12 黑河19 黑龙江 1998 57 开育10号 辽宁 1989 Heihe 19 Heilongjiang Kaiyu 10 Liaoning 13 黑河27 黑龙江 2002 58 长农5号 吉林 1990 Heihe 27 Heilongjiang Changnong 5 Jilin 14 丰收24 黑龙江 2003 59 吉林30 吉林 1993 Fengshou 24 Heilongjiang Jilin 30 Jilin 15 黑河38 黑龙江 2005 60 铁丰29 辽宁 1997 Heihe 38 Heilongjiang Tiefeng 29 Liaoning 16 北豆5号 黑龙江 2006 61 九农22 吉林 1999 Beidou 5 Heilongjiang Jiunong 29 Jilin 17 黑河43 黑龙江 2007 62 吉林47 吉林 1999 Heihe 43 Heilongjiang Jilin 47 Jilin 18 金元2号 黑龙江 1941 63 铁丰31 辽宁 2001 Jinyuan 2 Heilongjiang Tiefeng 31 Liaoning 19 满仓金 黑龙江 1941 64 吉育57 吉林 2001 Mancangjin Heilongjiang Jiyu 57 Jilin 20 荆山璞 黑龙江 1958 65 爬蔓青 山东 1929 Jingshanpu Heilongjiang Pamanqing Shandong 21 枝2号 吉林 1958 66 平顶式 河南 1957 Zhi 2 Jilin Pingdingshi Henan 22 东农4号 黑龙江 1959 67 牛毛黄 山东 1950 Dongnong 4 Heilongjiang Niumaohuang Shandong 23 合交8号 黑龙江 1962 68 平顶黄 山东 1951 Hejiao 8 Heilongjiang Pingdinghuang Shandong 24 合交6号 黑龙江 1963 69 新黄豆 山东 1952 Hejiao 6 Heilongjiang Xinhuangdou Shandong

表1 供试品种名称、来源及育成年份 Table 1 Variety name, geographic origin, and release year

续表1

Table 1

续表1(Table 1)

续表1 供试品种名称、来源及育成年份 Table 1 Variety name, geographic origin, and release year 编号 No. 品种 Variety 来源 Original province 育成年份 Release year 编号 No. 品种 Variety 来源 Original province 育成年份 Release year 25 黑农16 黑龙江 1970 70 莒选23 山东 1963 Heinong 16 Heilongjiang Juxuan 23 Shandong 26 綏农3号 黑龙江 1973 71 齐黄10号 山东 1966 Suinong 3 Heilongjiang Qihuang 10 Shandong 27 合丰22 黑龙江 1974 72 丰收黄 山东 1970 Hefeng 22 Heilongjiang Fengshouhuang Shandong 28 黑农26 黑龙江 1975 73 早丰1 河南 1971 Heinong 26 Heilongjiang Zaofeng 1 Henan 29 绥农4号 黑龙江 1981 74 文丰7号 山东 1971 Suinong 4 Heilongjiang Wenfeng 7 Shandong 30 合丰25 黑龙江 1984 75 兖黄1号 山东 1973 Hefeng 25 Heilongjiang Yanhuang 1 Shandong 31 黑农33 黑龙江 1988 76 跃进5 号 山东 1975 Heinong 33 Heilongjiang Yuejin 5 Shandong 32 绥农8号 黑龙江 1989 77 诱变30 北京 1983 Suinong 8 Heilongjiang Youbian 30 Beijing 33 黑农35 黑龙江 1990 78 冀豆4号 河北 1984 Heinong 35 Heilongjiang Jidou 4 Hebei 34 合丰35 黑龙江 1994 79 鲁豆4号 山东 1985 Hefeng 35 Heilongjiang Ludou 4 Shandong 35 绥农10号 黑龙江 1994 80 豫豆2号 河南 1985 Suinong 10 Heilongjiang Yudou 2 Henan 36 绥农14 黑龙江 1996 81 中豆19 湖北 1987 Suinong 14 Heilongjiang Zhongdou 19 Hubei 37 黑农43 黑龙江 2002 82 科丰6号 北京 1989 Heinong 43 Heilongjiang Kefeng 6 Beijing 38 黑农44 黑龙江 2002 83 冀豆7号 河北 1992 Heinong 44 Heilongjiang Jidou 7 Hebei 39 合丰45 黑龙江 2003 84 鲁豆11 山东 1995 Hefeng 45 Heilongjiang Ludou 11 Shandong 40 合丰50 黑龙江 2006 85 冀豆12 河北 1996 Hefeng 50 Heilongjiang Jidou 12 Hebei 41 黄宝珠 吉林 1923 86 豫豆22 河南 1997 Huangbaozhu Jilin Yudou 22 Henan 42 小金黄 吉林 1941 87 中黄13 北京 2001 Xiaojinhuang Jilin Zhonghuang 13 Beijing 43 丰地黄 吉林 1943 88 郑92116 河南 2001 Fengdihuang Jilin Zheng 92116 Henan 44 集体1号 辽宁 1956 89 邯豆5号 河北 2004 Jiti 1 Liaoning Handou 5 Hebei 45 集体5号 吉林 1956 Jiti 5 Jilin

续表1 供试品种名称、来源及育成年份 Table 1 Variety name, geographic origin, and release year

利用150对SSR引物对89份材料的基因组进行扩增, 其中125对引物得到清晰多态性条带, 可用于多态性分析。125对SSR引物共检测出685个等位变异, 平均等位变异数为5.48个, 等位变异的变化范围为1~14个, 以Satt373等位变异数最多(14个), Satt006最少(1个)(表2)

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 部分SSR引物在89个大豆品种中的等位变异情况及PIC值 Table 2 Allele numbers of SSR primers in 89 soybean varieties and their PIC 连锁群 LG 位点 Locus 等位变异数Allele number PIC HN HS JL YHH HN HS JL YHH* A1 Satt449 3 5 5 7 0.512 0.677 0.858 0.859 A2 Satt187 2 3 3 2 0.609 0.526 0.517 0.211 B1 Satt251 3 2 2 6 0.315 0.083 0.153 0.603 Sat_123 4 4 6 7 0.284 0.858 0.582 0.877 C1 SOYGPATR 3 3 3 3 0.554 0.546 0.604 0.509 Sat_085 3 4 5 8 0.394 0.431 0.740 0.891 C2 Satt640 3 3 2 4 0.547 0.461 0.720 0.645 Satt557 2 2 4 3 0.208 0.386 0.413 0.395 D1a Satt321 2 3 3 4 0.415 0.537 0.497 0.626 Satt077 2 2 3 3 0.457 0.491 0.469 0.586 D1b satt634 2 2 2 2 0.360 0.491 0.444 0.254 D2 Satt002 4 4 3 5 0.637 0.724 0.344 0.638 Satt310 1 2 2 4 0 0.083 0.278 0.605 E Satt720 3 3 5 6 0.457 0.474 0.793 0.758 Satt606 2 3 5 8 0.360 0.477 0.658 0.805 F Satt149 3 2 5 4 0.543 0.315 0.724 0.624 Satt335 1 1 2 4 0 0.087 0.406 0.448 G Satt309 4 3 3 4 0.522 0.577 0.344 0.638 Satt288 6 5 5 8 0.768 0.677 0.769 0.874 H Satt314 1 2 2 2 0.114 0.164 0.512 0.218 Satt270 2 2 2 5 0.360 0.575 0.545 0.541 I Satt405 1 2 2 3 0.360 0.149 0.288 0.150 Satt380 3 3 4 4 0.602 0.628 0.587 0.723 J Satt244 5 5 4 8 0.758 0.798 0.675 0.574 Satt544 4 3 7 5 0.394 0.233 0.986 0.678 K Satt143 4 6 6 7 0.689 0.807 0.774 0.568 Satt561 2 2 2 2 0.498 0.491 0.080 0.493 L Satt373 4 5 5 8 0.588 0.726 0.747 0.726 Satt463 4 5 6 5 0.664 0.578 0.660 0.691 Satt006 1 1 1 1 0.000 0.000 0.000 0.000 M Satt152 4 6 5 5 0.713 0.794 0.672 0.637 Satt257 2 1 3 3 0.111 0 0.550 0.368 O Satt022 3 3 4 6 0.304 0.616 0.844 0.790 Satt477 3 2 2 3 0.287 0.083 0.288 0.235 HN、HS、JL和YHH分别表示黑龙江北部、黑龙江中南部、吉林辽宁地区和黄淮海地区。 HN: north part of Heilongjiang Province; HS: south part of Heilongjiang Province; JL: Jilin and Liaoning Provinces; YHH: Yellow-Huai-Hai Rivers Valley.

表2 部分SSR引物在89个大豆品种中的等位变异情况及PIC值 Table 2 Allele numbers of SSR primers in 89 soybean varieties and their PIC

在东北地区64份大豆材料中共检测出527个等位变异, 平均等位变异数为4.22个; 在黄淮海地区25份材料中共检测出543个等位变异(表3), 平均等位变异数为4.31个。在这些等位变异中, 有118个为东北地区品种所特有, 其中黑龙江北部品种有5个特有等位变异, 黑龙江中南部品种中有29个特有等位变异, 吉林辽宁地区品种有84个特有等位变异; 黄淮海地区品种有125个特有等位变异。

在20世纪黑龙江北部80年代以前育成的12个大面积种植品种共有293个等位变异, 平均等位变异数为2.34个, 位点多态性信息含量(PIC)变幅为0~0.898, 平均为0.400; 80年代以后育成的13个大面积种植品种共有279个等位变异, 平均等位变异数为2.23个, 位点多态性信息含量(PIC)变幅为0~0.830, 平均为0.340。黑龙江中南部80年代以前的12个大面积种植品种共有333个等位变异, 平均等位变异数为2.660个, 位点多态性信息含量(PIC)变幅为0~0.810, 平均为0.386; 80年代后育成的13个大面积种植品种共有337个等位变异, 平均等位变异数为2.700个, 位点多态性信息含量(PIC)变幅为0~0.847, 平均为0.434。吉林、辽宁地区80年代以前的12个大面积种植品种共有349个等位变异, 平均等位变异数为2.79个, 位点多态性信息含量(PIC)变幅为0~0.833, 平均为0.433; 80年代后育成的13个大面积种植品种共有381个等位变异, 平均等位变异数为3.05个, 位点多态性信息含量(PIC)变幅为0~0.931, 平均为0.474。黄淮海地区80年代以前12个大面积种植品种共有418个等位变异, 平均等位变异数为3.32个, 位点多态性信息含量(PIC)变幅为0~0.875, 平均为0.505; 80年代后育成的13个大面积种植品种共有457个等位变异, 平均等位变异数为3.66个, 位点多态性信息含量(PIC)变幅为0~0.840, 平均为0.533。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 不同地区大面积种植大豆品种的等位变异 Table 3 Allele of widely-planted soybean varieties from different regions of China 地区 Region 品种数量 Variety number 等位变异数 Allele number 平均等位变异数 Average allele number PIC 变幅Range 平均Mean 黑龙江北部 HN 17 340 2.70 0-0.789 0.414 黑龙江中南部 HS 23 396 3.14 0-0.818 0.469 吉林辽宁地区 JL 24 427 3.39 0-0.854 0.522 黄淮海地区 YHH 25 543 4.31 0-0.926 0.562 HN: north part of Heilongjiang Province; HS: south part of Heilongjiang Province; JL: Jilin and Liaoning Provinces; YHH: Yellow-Huai-Hai Rivers Valley.

表3 不同地区大面积种植大豆品种的等位变异 Table 3 Allele of widely-planted soybean varieties from different regions of China

从以上结果可以看出, 除黑龙江北部外, 其余3个地区80年代后育成的大面积种植品种的平均等位变异数和多态性信息含量均比80年代以前有所提高, 说明这些地区后来育成的大面积种植品种的遗传多样性更加丰富。

20世纪40年代以来, 东北和黄淮海地区大面积种植品种的相似系数在0.244~0.863之间, 其中, 豫豆2号和吉林6号之间的相似系数最小, 集体1号和吉林6号之间的相似系数最大。89个品种在相似系数为0.36时被分为3大类(图1), 东北地区全部品种和黄淮海地区绝大多数品种分属I、II两大类, 黄淮海北部品种冀豆12(序号85)被单独分为一类(III)。第I大类包括所有的东北地区大面积种植品种和2个黄淮海北部地区品种(冀豆7号和鲁豆11)。在相似系数为0.44时, 东北地区品种主要可以分为2个亚类。第一亚类主要为来自吉林辽宁地区的品种和黄淮海北部品种冀豆7号和鲁豆11, 这2个黄淮海品种具有东北地区重要亲本丰地黄和熊岳小黄豆的血缘; 第二亚类主要为来自黑龙江地区的品种和来自吉林辽宁地区的品种九农22和铁丰31。第II大类22个品种全部来自黄淮海地区。在相似系数为0.402时, 第II大类又可以进一步划分为3个亚类, 第一亚类包括爬蔓青和菏泽牛毛黄2个农家品种; 第二亚类包括益都平顶黄、丰收黄、齐黄10号、莒选23、河南早丰1号和文丰7号等, 主要是益都平顶黄和莒选23选育出的后代; 第三亚类包括中豆19、诱变30、科丰6号、中黄13、豫豆2号、豫豆22和邯豆5号等品种, 它们都具有共同的祖先亲本滨海大白花和铜山天鹅蛋。聚类与系谱分析的结果一致, 进一步证明用SSR标记进行聚类分析的可靠性。

东北地区品种之间相似系数平均值为0.458, 其中黑龙江北部品种0.560, 黑龙江中南部品种0.529, 吉林辽宁地区品种为0.495。黄淮海地区品种之间的相似系数平均值为0.417, 黄淮海地区品种与东北地区品种之间的相似系数平均值为0.357。由此可见, 黑龙江北部大面积种植品种之间相似系数最高, 其他依次为黑龙江中南部、吉林辽宁地区和黄淮海地区, 与通过PIC值得到的各地区品种遗传多样性大小相吻合。黑龙江北部地区品种遗传多样性最低的原因可能与该地区育种起步较晚且基本采用本省品种资源做亲本选育品种有关, 而其他3个地区在品种培育过程中均重视选用异地资源做亲本, 品种遗传多样性水平较高。

研究表明, 黑龙江北部、黑龙江中南部、吉林辽宁地区和黄淮海地区大面积种植品种SSR标记的平均多态性信息含量(PIC)依次为0.414、0.469、0.522和0.562, 与通过相似系数计算的结果相符, 说明黄淮海地区大面积种植品种的遗传多样性最高, 这也与我们先前的系谱分析结果一致^[8]。黄淮海地区大豆品种多态性信息含量高与该地区大豆的遗传资源比较丰富、品种的祖先亲本较多有关。吉林辽宁地区大面积种植品种遗传多态性居第二, 其次是黑龙江省。黑龙江北部地区20世纪80年代后育成的大面积种植品种的遗传多样性要低于中南部, 且低于20世纪80年代前, 该地区大豆品种遗传多样性降低的趋势值得大豆育种工作者注意。

图1

Fig. 1

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	图1 89个大面积种植品种基于SSR标记的聚类图数字代表的品种名称见表1。The number of variety name corresponds with that given in Table 1.Fig. 1 Cluster analysis of 89 widely-planted varieties based on SSR markers

栾维江等^[27]曾对283份东北大豆进行SSR检测, 认为吉林和辽宁地区品种的遗传多样性高于黑龙江品种, 与本研究结果一致。赵洪锟等^[28]对中国不同纬度大豆资源SSR分析发现无论是野生大豆还是栽培大豆, 随地理纬度的增加其遗传距离都有递减的趋势, 表明北方大豆多样性低于南方。20世纪80年代以来, 新育成品种比老品种遗传多样性高(黑龙江北部除外), 这与育种方法和技术的改进是相符的。盖钧镒等^[29]认为新近育成的品种比老品种涉及更多的祖先亲本, 遗传基础有所拓宽。

高运来等^[30]利用43对SSR引物分析83个黑龙江省主栽的大豆品种, 发现引物的平均多样性指数为0.55, 高于本文中同地区品种多样性指数的高值0.469, 说明大面积种植品种比普通品种的遗传多样性稍低, 可能原因是大面积种植品种必须保留共有的优良性状和基因。此外, 本文选用的是与主要农艺和产量性状相关的SSR标记, 在育种过程中对上述目标性状的选择可能致使其PIC降低。Wang等^[31]利用60对SSR标记分析14个在农艺和形态性状上有差异的中国栽培大豆品种的遗传多样性, 得到的多态性信息含量(PIC)为0.50~0.92, 平均为0.78。Wang等^[32]利用40对SSR标记分析40份山西大豆育成品种、地方品种和野生资源, 共得到262个等位变异, 平均每个SSR引物的等位变异数为6.55, PIC为0.585~0.850, 平均为0.78, 发现野生大豆、地方品种和育成品种的遗传多样性指数分别为1.5421、1.2864和1.0981。上述两项研究所得PIC数值均高于本研究中的PIC高值0.562, 由此看出大豆在驯化和育种过程中遗传多样性逐渐降低, 地方品种和普通育成品种遗传多样性低于野生大豆, 而大面积种植品种的遗传多样性又低于普通育成品种, 同质化趋势相当明显, 这一方面说明大面积种植品种含有许多共有的优良基因, 是优良基因的聚合体, 另一方面也说明大面积种植品种的遗传基础仍有待拓宽。

Diwan等^[33]的研究结果显示, 在北美大豆品种的35个祖先亲本中, 平均每个SSR引物的等位变异数为10.1, PIC为0.64~0.91, 平均为0.8。Chen等^[34]分析122份抗大豆胞囊线虫(SCN)资源, 发现每个SSR位点的平均等位变异数为6.70, PIC在0.02~0.50之间变化, 平均为0.35。Hwang等^[35]分析包括优良品种在内的87个日本野生大豆种质和栽培品种, 发现377个SSR位点的平均等位变异数为3.7个, PIC均值为0.44。这些研究结果与我们的结果类似, 说明无论在国内还是国外, 育成品种的遗传多样性相近, 而祖先亲本的遗传多样性则丰富得多。

大面积种植品种是众多育成品种的优秀代表, 经过多年多点环境条件的考验, 与普通育成品种相比, 它们稳产性更好、适应性更广泛, 因而得到种植者和育种家的认可。东北和黄淮海地区是我国大豆主产区, 产量占全国的3/4以上, 对这2个地区不同年代大面积种植品种的遗传多样性分析, 能反映我国大豆育成品种在分子水平上的变化趋势, 对于今后的大豆育种工作具有一定指导意义。本研究结果表明, 尽管新近育成的大豆品种遗传多样性有所提高, 但大面积种植品种与普通育成品种相比其遗传多样性仍相对较低。这就要求我们在今后的品种选育中多选用地理远缘、遗传关系较远、含有不同优异等位变异的材料做亲本, 拓宽育成品种的遗传基础, 提高其适应能力, 避免育成品种遗传构成的同质化。黄淮海流域是我国南北大豆产区的交汇地带, 无霜期较长, 品种资源丰富, 是不同来源大豆品种相互组配的理想区域。此外, 随着生育期相关基因的克隆^{[36,37,38,39,40,41]}, 通过生物技术手段可改变现有大面积种植品种的开花期和成熟期, 从而拓展其适应区域, 使其在异地种植或做亲本材料, 提高其利用价值。