引用本文
王瑞, 吴华玲, 王会芳, 黄珂, 霍春艳, 倪中福, 孙其信. 小麦TaWRKY44 基因的克隆、表达分析及功能鉴定 . 作物学报, 2013, 39(11): 1944-1951[WANG Rui, WU Hua-Ling, WANG Hui-Fang, HUANG Ke, HUO Chun-Yan, NI Zhong-Fu, SUN Qi-Xin. Cloning, Characterization, and Functional Analysis ofTaWRKY44 Gene from Wheat . 作物学报, 2013, 39(11): 1944-1951]  
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小麦TaWRKY44 基因的克隆、表达分析及功能鉴定
王瑞1,2,**, 吴华玲3,**, 王会芳1,2, 黄珂1,2, 霍春艳1,2, 倪中福1,2, 孙其信1,2,*
1农业生物技术国家重点实验室 / 北京市作物遗传改良重点实验室 / 中国农业大学, 北京 100193
2国家植物基因研究北京中心, 北京 100193
3广东省农业科学院茶叶研究所, 广东广州 510640

* 通讯作者(Corresponding author): 孙其信, E-mail:qxsun@cau.edu.cn** 同等贡献(Contributed equally to this work)

收稿日期:2013-06-25
基金:本研究由国家转基因生物新品种培育科技重大专项(2011ZX08009-084B), 国家自然科学基金重大项目(31290210)和国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2012AA10A309)资助。
摘要

WRKY 是植物特有的转录因子基因, 在植物对外界胁迫响应及生长发育的过程中发挥重要作用。本研究克隆了一个新的小麦WRKY 转录因子基因TaWRKY44 , 获得其全长cDNA, 其中开放阅读框长度为897 bp, 编码298个氨基酸。半定量RT-PCR的结果表明,TaWRKY44 在叶片中表达水平较高, 并且受干旱和低温胁迫诱导表达。转基因功能分析结果表明,TaWRKY44 的拟南芥超表达株系叶片变小, 叶柄缩短, 并且叶片细胞也明显小于野生型。另外, 转基因系对ABA、干旱和盐等胁迫处理的敏感性也高于野生型, 说明该基因可能作为一个转录抑制子参与逆境胁迫信号转导过程。

关键词: 小麦; WRKY; 基因表达; 叶片; 逆境胁迫; 功能分析
Cloning, Characterization, and Functional Analysis ofTaWRKY44 Gene from Wheat
WANG Rui1,2,**, WU Hua-Ling3,**, WANG Hui-Fang1,2, HUANG Ke1,2, HUO Chun-Yan1,2, NI Zhong-Fu1,2, SUN Qi-Xin1,2,*
1 State Key Laboratory for Agrobiotechnology / Beijing Key Laboratory of Crop Genetic Improvement / China Agricultural University, Beijing 100193, China
2 National Plant Gene Research Centre (Beijing), Beijing 100193, China
3 Tea Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510640, China.
Abstract

WRKY transcription factors are specific in plants and related in response to stress as well as plant development. In this study, we cloned the full-length cDNA of a new WRKY transcription factor gene,TaWRKY44 , from wheat (Triticum aestivum L.). The open reading frame ofTaWRKY44 is 897 bp in length, which encodes 298 animo acid residues. The semi-quantitative RT-PCR result indicated thatTaWRKY44 was highly expressed in leaf, and responsive to drought and clod stresses.TaWRKY44 over-expressed lines ofArabidopsis exhibited smaller leaves, shorter leaf petioles, and smaller leaf epidermis cell than the wild type. In addition, the transgenic lines were more sensitive to abscisic acid, drought, and salt stresses. These results indicatedTaWRKY44 could be a negative regulator in stress signal transduction pathway.

Keyword: Wheat; WRKY; Gene expression; Leaf; Abiotic stress; Functional analysis
引言

WRKY 基因是植物中特有的一个转录因子家族, 得名于其保守结构域中包含有一个WRKYGQK的序列[1]。早在1994年, Ishiguro等克隆出第一个WRKY蛋白SPF1, 此后在许多生物相继有研究报道。最近研究结果显示, 拟南芥、水稻和玉米分别存在72、107和139个 WRKY 基因[2,3], 说明 WRKY 基因是由多个成员组成的大家族。在小麦中, 迄今仅克隆了58个 WRKY 基因[4,5]。因此, 分离和克隆小麦新的 WRKY 基因, 并鉴定其功能, 将为探讨 WRKY 基因与小麦生长发育的关系奠定重要基础。

研究发现, 植物 WRKY 转录因子基因广泛参与植物对生物及非生物胁迫的响应。在逆境胁迫下, 植物能够感知并传递胁迫信号, 激活下游转录因子, 启动抗逆相关基因的表达, 从而促使植物体内发生一系列的生理生化反应, 抵御不良环境的危害并提高植物的耐逆性。 HvWRKY38 在大麦中参与调控对干旱胁迫的响应[6], AtWRKY8 在拟南芥中则参与盐胁迫调控[7]。另外, 一些 WRKY 基因在植物生长发育过程中起重要作用。 GaWRKY1 在棉花中参与次生代谢物的合成, AtWRKY6 调控叶片衰老及成熟[8,9,10]。由此可见, WRKY 转录因子对于植物胁迫响应及调控生长发育具有重要的作用。

最近, Niu等[4]克隆了43个小麦 WRKY 基因, 并对其中2个基因( TaWRKY2 和 TaWRKY19 )的功能进行了鉴定, 发现 TaWRKY2 和 TaWRKY19 可能参与植物非生物逆境胁迫过程。在本研究中, 我们克隆了一个小麦 WRKY 基因 TaWRKY44 , 在表达模式分析的基础上, 对其功能进行了鉴定, 为深入探讨 TaWRKY44 基因与植物生长发育的关系奠定了基础。

1 材料与方法
1.1 植物材料及处理

2011年9月在中国农业大学上庄试验站田间种植小麦品种农大3338, 取分蘖盛期的叶片、分蘖节、根系、开花期叶片、衰老期叶片及授粉后12 d的种子提取RNA, 其中全长cDNA克隆材料为分蘖节。在光照培养箱中, 将小麦种子置培养皿滤纸上萌发, 培养条件为26℃(16 h)/20℃(8 h)(昼/夜), 相对湿度75%。至三叶期, 对幼苗进行干旱(20% PEG, 2 h和4 h)、低温(3℃, 30 min和60 min)、高温(40℃, 20 min和40 min)及高盐(10% NaCl, 20 min和40 min)胁迫处理, 并以正常生长幼苗为对照。取各处理叶片提取RNA进行表达分析。

亚细胞定位材料为新鲜洋葱表皮。

1.2 总DNA、RNA的提取纯化和cDNA的制备

采用CTAB法提取农大3338总DNA。用TRIzol (TIANGEN)提取小麦不同组织和不同处理时间点叶片的总RNA。按照TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix Kit (TransGen Biotech)操作说明合成cDNA, -20℃保存备用。

1.3 基因克隆和同源进化分析

按照吴华玲等[5]报道的方法, 以拟南芥和水稻中已报道的 WRKY 基因为搜索序列, 在GenBank数据库中(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行同源比对搜索, 找出小麦中相关的EST序列后进行电子拼接, 获得包含完整开放阅读框(ORF)的cDNA序列后进行氨基酸序列比对分析, 筛选出未报道的新基因, 然后设计基因特异引物P1-L和P1-R (表1), 再分别以农大3338 DNA和分蘖节cDNA为模板进行PCR扩增, 反应总体积为20 μL, 包括反转录产物2 μL、10 mmol L-1 dNTPs 0.4 μL、20 ng μL-1基因特异引物2 μL、 Taq DNA聚合酶1 U。PCR扩增程序为94℃ 5 min; 94℃ 1 min, 63℃ 1 min, 72℃ 1.5 min, 35个循环; 最后72℃ 5 min。PCR产物采用1%琼脂糖凝胶电泳后, 将目标片段进行回收、克隆和测序。根据RT-PCR产物的测序结果, 设计5′和3′RACE引物(表1), 用5′-Full RACE Kit with TAP试剂盒和3′-Full RACE Core Set with PrimeScript RTase (TaKaRa)进行全长cDNA的克隆。同源进化分析采用ClustalX软件。

1.4 基因表达模式的分析

取农大3338分蘖盛期的叶片、根、分蘖节、授粉后12 d的种子、苗期、开花期和衰老期的叶片, 提取RNA并反转录。同时取苗期农大3338幼苗进行胁迫处理, 提取RNA并反转录。以 β-actin 为内标基因进行半定量RT-PCR分析, 引物序列见表1。反应总体积为20 μL, 包括反转录产物2 μL、10×buffer 2 μL、10 mmol L-1 dNTPs 0.4 μL、20 ng μL-1基因特异引物(P1-L和P1-R) 2 μL、 Taq DNA聚合酶1 U。PCR扩增程序为94℃, 5 min; 94℃ 1 min, 60℃ 1 min, 72℃ 1.5 min, 25个循环; 最后72℃延伸5 min。设3个生物学重复。

1.5 WRKY转录因子的亚细胞定位

为设计引物构建融合表达载体, 在 WRKY 基因特异引物上游和下游分别引入 Eco R I与 Hin d III的酶切位点(P2-L和P2-R, 表1), 从农大3338分蘖盛期叶片cDNA中扩增出带有以上酶切位点的ORF片段, 将片段从琼脂糖胶回收后连接到T-easy (TaKaRa)载体上, 然后以 Eco R I和 Hin d III对连接载体进行双酶切, 凝胶电泳后回收片段与同样双酶切后线性化的pEGAD载体(由中国农业大学生物学院巩志忠教授提供)连接, 获得绿色荧光蛋白与目的基因的融合蛋白表达载体。

取一块长、宽大约4 cm的洋葱幼嫩表皮, 在固体MS培养基上22℃培养3~4 h。采用PDS-1000/He基因枪(Bio-Rad)轰击洋葱表皮细胞, 可裂膜压力为1100 psi, 轰击距离约为5 cm。轰击的洋葱表皮细胞于22℃培养箱中培养14~16 h, 于激光共聚焦显微镜下(Leica, TCS SP2)观察GFP的表达定位。

1.6 拟南芥超表达载体构建和转化

在 WRKY 基因特异引物的两端引入酶切位点( Xba I和 Kpn I)(P3-L和P3-R, 表1), 用于构建超表达载体。将扩增得到的片段从凝胶电泳回收后, 与T-easy载体连接, 然后用 Xba I和 Kpn I双酶切, 凝胶电泳后回收片段与同样双酶切后线性化的PCAMBIA Super1300载体(载体由中国农业大学生物学院巩志忠教授提供)相连接, 获得超表达载体。将超表达载体进行农杆菌转化(农杆菌菌株为GV3101, 由中国农业大学生物学院巩志忠教授提供), 得到的阳性菌液采用蘸花法侵染拟南芥野生型植株(种子由中国农业大学生物学院巩志忠教授提供), 收获成熟T0代种子。T0代种子经消毒后, 点播在MS选择培养板上(30 mg L-1潮霉素)。4℃下春化3 d后, 移入光照培养箱中(22℃恒温, 24 h光照, 光强30~40 µmol m-2s-1)。10 d后挑选真叶健康并呈深绿色, 根伸长至培养基中的转化体。将转化体幼苗移入土中(营养土体积∶蛭石体积=1∶1), 至收获T1代种子。经卡方检测, 筛选出符合3∶1分离比例的T1代种子; 种植该T1代种子, 获得T2代纯系种子。

表1 本研究所用引物 Table 1 Primers used in this study

为检测转基因株系中 WRKY 基因插入片段的拷贝数, 剪取3个转基因株系叶片, 提取DNA后进行Southern blot分析, 野生型叶片作为对照。使用 Eco R I和 Kpn I双酶切基因组DNA,在含有TAE缓冲液的0.8% ( W / V )琼脂糖胶中电泳, 将DNA片段转移到尼龙膜上, 用α-32P-dCTP标记的 WRKY 基因PCR扩增片段为探针进行杂交,最后经过放射显影。同时, 提取3个转基因株系和野生型叶片RNA后进行反转录, 用RT-PCR方法检测 WRKY 基因在转基因株系中是否正常表达, 检测引物同 WRKY 基因表达引物。

1.7 拟南芥超表达株系与野生型表型及抗逆性分析

将转小麦 WRKY 基因的拟南芥T2代幼苗移栽到土中, 生长16 d后取完全展开的第3叶片, 剪成约1 cm2的小段, 煮沸10 min, 倒弃上清液; 转至95%乙醇中, 煮沸约1 h至组织完全脱色; 迅速将已褪色的材料置预先加热至96℃的85%乳酸中, 约8 min后可观察到透明组织; 将已透明的材料转移至室温乳酸中, 取表皮细胞制片, 于倒置显微镜(Olympus, IX71)下拍照。

对拟南芥超表达株系与野生型进行抗逆性分析, 选取在温室中MS培养基上竖直萌发5 d后的幼苗(16 h昼/8 h夜, 22℃, 相对湿度40%), 待根长约2 cm时在无菌条件下移至分别加有甘露醇(400 mmol L-1)、NaCl (100 mmol L-1)和ABA (30 µmol L-1)的MS培养基平板上, 观察转基因植株和野生型在逆境胁迫下的表型差异。

2 结果与分析
2.1 TaWRKY44 的全长cDNA克隆

采用电子克隆方法获得含有完整ORF的小麦 WRKY 新基因, 其特异引物扩增产物长度约为900 bp。扩增产物经克隆测序后发现ORF长度为897 bp, 编码298个氨基酸, 将该基因命名为 TaWRKY44 。利用RACE方法克隆了3′和5′非翻译区(UTR)的序列, 长度分别为312 bp和178 bp。将RT-PCR与RACE序列进行拼接获得一条长度为1397 bp的全长cDNA。

氨基酸序列分析表明, TaWRKY44 基因编码的蛋白具有典型的WRKY结构域及C2H2锌指结构(图1-A)。TaWRKY44与水稻OsWRKY13和OsWRKY14及拟南芥AtWRKY65和AtWRKY69归为一个小的类群(图1-B)。基因组序列分析结果显示, TaWRKY44 编码区内仅含有一个内含子, 长度为184 bp。在拟南芥中, WRKY 家族基因的内含子位置高度保守, 可以分为两种类型, 一种是位于编码R的位点, 在密码子AGG中的2个GG之间剪接, 称为R型内含子; 另一种内含子在编码V (缬氨酸)的位点前剪接, V位于锌指结构C2H2的第2个C (半胱氨酸)之后的第6个位点, 称为V型内含子[2]。分析发现, TaWRKY44 的内含子位于氨基酸R的位点, 所以属于R型内含子(图2)。

图1 TaWRKY44系统进化树A图中, 星号(*)表示WRKY保守氨基酸残基。Fig. 1 Phytogenic tree of TaWRKY44Asterisks in panel A show the conserved amino acid residues.

图2 TaWRKY44 基因组内含子位置方框表示WRKY保守结构域。Box represents conserved WRKY domain.Fig. 2 Intron site of TaWRKY44

2.2 TaWRKY44 基因的表达模式分析

该基因在小麦分蘖盛期的叶片中表达较高, 在根和分蘖节中相对偏低, 在授粉后12 d的种子中没有表达(图3-A)。以不同发育时期的叶片为材料研究发现, TaWRKY44 基因在苗期和开花期叶片中表达水平明显低于衰老期叶片(图3-B)。另外, TaWRKY44 在低温胁迫30 min时表达显著上调, 而到60 min时则下调表达(图3-C); 干旱胁迫处理4 h时 TaWRKY44 表达明显上调(图3-D)。但是该基因在高温(40℃)和高盐(10% NaCl)条件下表达模式与对照相比并未发生明显变化。

图 3 TaWRKY44 的组织表达特异性(A)叶片表达模式(B)及低温(C)和干旱胁迫(D)表达响应1: 授粉后12 d的种子; 2: 分蘖盛期的分蘖节; 3: 分蘖盛期的分蘖叶; 4: 分蘖盛期的分蘖根。5: 幼叶; 6: 开花期叶片; 7: 衰老叶片。8: 室温 (30 min); 9: 3 ℃ (30 min); 10: 室温 (60 min); 11: 3 ℃ (60 min)。12: H2O (2 h); 13: 20% PEG (2 h); 14: H2O (4 h); 15: 20%PEG (4 h)。Fig . 3 Tissue-specific expression of TaWRKY44 (A) expression patterns of leaves (B) and low temperature (C) and drought stress (D) expression in response1: seeds of 12 days after pollination; 2: inter-node at tillering stage; 3: leaves at tillering stage; 4: root at tillering stage. 5: young leaves; 6: leaves at flowing stage; 7: aged leaves. 8: room temperature for 30 min; 9: 3 °C for 30 min; 10: room temperature for 60 min; 11: 3 °C for 60 min. 12: H2O for 2 h; 13: 20% PEG treatment for 2 h; 14: H2O for 4 h; 15: 20% PEG for 4 h.

2.3 TaWRKY44蛋白的亚细胞定位

对 TaWRKY44 基因亚细胞定位融合载体用基因枪轰击法转入洋葱表皮细胞, 用pEGAD表达载体作为对照。经过培养后, 在激光共聚焦显微镜下观察, 显示对照GFP蛋白可以在整个细胞中见到比较均一的明亮的绿色荧光(图4-a, b, c), 而pEGAD- TaWRKY44融合蛋白则位于细胞核中(图4-d, e), 说明TaWRKY44蛋白是核定位的转录因子。

图4 TaWRKY44蛋白亚细胞定位GFP: pEGAD载体在洋葱表皮细胞中的瞬时表达在暗场(a)、明场(b)和暗场、明场叠加(c)观察。TaWRKY44:GFP: pEGAD-TaWRKY44融合表达载体在洋葱表皮细胞中的瞬时表达暗场(d)、明场(e)和暗场、明场叠加(f)观察。Fig. 4 Subcellular localization of TaWRKY44 proteinGFP: images of green fluorescence GFP of pEGAD vector in onion epidermal cells under dark-field (a)、bright-field (b) and overlapped field (c). TaWRKY44:GFP: images of green fluorescence GFP of pEGAD-TaWRKY44 vector in onion epidermal cells under dark-field (d)、bright-field (e) and overlapped field (f).

2.4 TaWRKY44 拟南芥超表达株系的分析及其与野生型的比较

为分析 TaWRKY44 转录因子基因的功能, 构建了 TaWRKY44 的拟南芥超表达载体, 并获得5个超表达后代纯系。对其中3个( 35S:TaWRKY44-4 、 35S: TaWRKY44-12 和 35S:TaWRKY44-16 )进行Southern blot鉴定, 发现转基因株系都含有一个目的基因拷贝, 说明 TaWRKY44 基因已经整合到拟南芥基因组中(图5-A)。RT-PCR表达分析结果表明, 3个转基因株系中都检测到外源目的基因的表达, 而野生型对照则无相应的扩增产物, 说明 TaWRKY44 在这些转基因植株中正常表达, 并没有发生基因沉默(图5-B)。

图 5 35S:TaWRKY44 转基因株系的Southern blot (A)和RT-PCR (B)Fig . 5 Analysis of 35S:TaWRKY44 transgenic linesWT: wild type; 1: 35S:TaWRKY44-4; 2: 35S:TaWRKY44-12; 3: 35S:TaWRKY44-16.

与野生型相比, TaWRKY44 超表达拟南芥植株的叶片变小且叶柄缩短(图6)。细胞学观察结果表明, 超表达株系 35S:TaWRKY44-4、35S:TaWRKY44-12 和 35S:TaWRKY44-16 叶片表皮细胞大小分别为1502、1660和1997 µm2, 分别比野生型低49.5%、44.1%和32.8% (图7), 说明超表达株系中的叶片细胞明显变小。

甘露醇、NaCl和ABA逆境处理3 d后, 在添加ABA的MS培养基上, 转基因植株的两片子叶已经完全变白, 真叶也逐渐开始失绿白化, 而野生型植株叶片除子叶颜色开始变白外, 其余的保持正常绿色(图8-B); 在添加甘露醇的MS培养基上, 转基因植株的2片子叶已经完全黄化, 而WT植株的子叶颜色刚开始呈现变黄的趋势(图8-C); 在高盐NaCl处理条件下, 转基因植株顶端生长点处已经出现明显的褐化, 心叶逐渐死亡, 而WT植株还未出现顶端褐化的现象(图8-D)。

3 讨论

WRKY 转录因子是近年来研究较为广泛的植物转录因子基因。在许多植物中克隆了 WRKY 基因, 并对其功能进行了深入研究。近年来, Wu等[5]和Niu等[4]分别在小麦中克隆了15个和43个 WRKY 基因, 并在拟南芥中进行了功能验证。在本研究中, 我们克隆了一个新的小麦 WRKY 基因, 命名为 TaWRKY44 , 其所编码蛋白与水稻OsWRKY14同源性最高。该基因受干旱诱导表达, 并且在衰老的叶片中表达水平升高, 说明该基因可能参与了小麦逆境胁迫响应及叶片衰老过程。

叶片大小是植物形态的一个重要特征, 是由细胞数目和细胞大小相互协调的结果。在模式植物拟南芥中, 一些控制叶片细胞大小的关键基因最近相继被克隆和鉴定出来。例如, AtEXP10 、 ROTUNDIFOLIA 3 (ROT3) 、 ANGUSTIFOLIA(AN) 和 ARGOS- LIKE(ARL) 通过促进细胞的伸长来调节器官发育[11,12,13,14,15,16]。

图6 35S:TaWRKY44 转基因株系和野生型叶片表型及叶片表面积统计Fig. 6 Leaf area of 35S:TaWRKY44 transgenic lines and WT with their phenotypeWT: wild type; 1: 35S:TaWRKY44-4; 2: 35S:TaWRKY44-12; 3: 35S:TaWRKY44-16.

图7 35S:TaWRKY44 转基因株系和野生型叶片细胞观察Fig. 7 Leaf epidermis cell size of 35S:TaWRKY44 transgenic lines and WT with microscopic viewWT: wild type; 1: 35S:TaWRKY44-4; 2: 35S:TaWRKY44-12; 3: 35S:TaWRKY44-16.

图8 35S:TaWRKY44 转基因株系和野生型(WT)胁迫处理后的表型A: MS培养基; B: ABA处理(30 µmol L-1); C: 甘露醇处理(400 mmol L-1); D: NaCl (100 mmol L-1)处理。Fig. 8 Phenotype of 35S:TaWRKY44 transgenic lines and WT under different stressesA: MS medium; B: MS+ABA (30 µmol L-1); C: MS+mennitol (400 mmol L-1); D: MS+NaCl (100 mmol L-1).

但是, BIGPETALp (BPEp) 和 RPT2a 通过限制细胞的伸长来控制器官生长[17,18,19]。在本研究中, TaWRKY44 基因的拟南芥超表达株系叶片变小及叶柄缩短, 并且细胞也明显小于野生型, 说明该基因主要通过调控细胞大小来影响叶片发育。进一步的研究重点是深入解析该基因调控叶片发育的分子机制, 目前, 我们已建立超表达株系和野生型叶片转录组差异表达谱, 筛选出一些候选下游基因, 正在进行功能鉴定。

同源进化聚类结果显示, TaWRKY44与水稻的OsWRKY13、OsWRKY14及拟南芥的AtWRKY65和AtWRKY69归为一个小的类群。在水稻中, OsW- RKY13 通过调控水杨酸和茉莉酸依赖的防御相关基因提高抗病性[20]。 OsWRKY14 可能在MeOH诱导的Trp及其次生衍生物的生物合成中发挥关键调节作用[21]。迄今为止, 拟南芥的 AtWRKY65 和 AtWRKY69 基因的功能研究尚未见报道。我们发现 TaWRKY44 基因的拟南芥超表达株系叶片明显变小, 并且对ABA、甘露醇以及高盐处理更为敏感。我们推测 TaWRKY44 可能与水稻的同源基因 OsWRKY13 和 OsWRKY14 在功能上存在分化, 但需要进一步的实验证据。

4 结论

获得了 TaWRKY44 基因, 编码Group II型核定位WRKY转录因子。超表达拟南芥植株表现出叶片变小、叶片细胞变小的现象, 并且对ABA、甘露醇以及盐胁迫处理更为敏感。

The authors have declared that no competing interests exist.

作者已声明无竞争性利益关系。The authors have declared that no competing interests exist.

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