粳稻9804- Rxo1 ( Rxo1 基因转入9804)、根癌农杆菌( Agrobacterium tumefaciens )菌株EHA105、细菌性条斑病菌Rs105均由本实验室保存。大肠杆菌( Escherichia coli )菌株DH5α购于北京博迈德公司。实验质粒载体(图1), 即Gateway中间载体pDONR201和RNAi载体pB7GWIWG2(II)^[13], 均购于Invitrogen公司, 绿色荧光蛋白载体pN-GFP, 由中国农业科学院作物科学研究院傅永福研究员惠赠。

质粒提取试剂盒和琼脂糖胶回收试剂盒均购于天根公司。TRIzol购于Invitrogen公司, 反转录试剂盒和DNase I均购于Promega公司。荧光定量PCR试剂和PrimeSTAR DNA Polymerase均购于TaKaRa, Taq DNA聚合酶由本实验室保存。实验中所用引物(表1), 均由北京赛百盛基因技术有限公司合成。培养基均购于北京鼎国生物技术有限责任公司。

根据水稻基因LOC_Os03g49620.4序列, 使用Primer Premier 5.00设计引物OEBF/R。PrimeSTAR PCR扩增获得目的基因编码序列, 共1815 bp。以Gateway技术构建pN-GFP- OsBAK1L 融合载体^[14]。

图1

Fig. 1

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	图1 实验载体pDONR201: 中间载体, pB7GWIWG2(II): RNAi表达载体, pN-GFP: 亚细胞定位载体。Fig. 1 Vectors in the studypDONR201: entry vector, pB7GWIWG2(II): RNAi expression vector, pN-GFP: subcellular location vector.

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 构建载体和表达分析引物 Table 1 Primers for vector construction and expression analysis 引物 Primer 序列 Sequences (5°-3°) 用途 Purpose 片段大小 Fragment size (bp) ActinF GACTCTGGTGATGGTGTCAGC 半定量 PCR Semi-quantitative PCR 332 ActinR GGCTGGAAGAGGACCTCAGG RTBF CAACTACGACGGGCAGGAG 半定量 PCR Semi-quantitative PCR 460 RTBR CAGATGCGACTTGGGACT 35S GACGCACAATCCCACTATCC 转基因苗检测 Transgenic plant identification 1000 RiBR GCTCAGGTATGCCACCAGTAA 转基因苗检测 Transgenic plant identification BarF TTCGGTGACGGGCAGGAC 转基因苗检测 Transgenic plant identification 731 BarR GCACCATCGTCAACCACTACAT 转基因苗检测 Transgenic plant identification RTMPK13F ATCAGTAACCAGCGTTCAGCC qRT-PCR表达分析 Expression analysis by qRT-PCR 245 RTMPK13R CTGCCAGGCTATGAGGAAAAT Att-OEBF GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCATGGGGAGGTGCCATACTGG OsBAK1L 克隆 Clone OsBAK1L 1818 Att-OEBR GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTCTGCCGGCGGAGAGCT Att-RiBF GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCGGTGAGGAGGTGAAGTGGGA OsBAK1L RNAi片段克隆 Clone the RNAi sequence of OsBAK1L 540 Att-RiBR GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGCTCAGGTATGCCACCAGTAA

表1 构建载体和表达分析引物 Table 1 Primers for vector construction and expression analysis

根据NCBI在线BLAST对 OsBAK1L 同源序列分析, 选择其中540 bp的特异核苷酸序列作为RNAi干扰区段。根据特异核苷酸序列设计引物RiBF/R, PrimeSTAR PCR扩增 OsBAK1L 干扰区段, 以Gateway技术构建 OsBAK1L -RNAi载体^[14]。

PrimeSTAR PCR反应程序(根据扩增片段大小和引物 T_m值, 相应调整延伸时间和退火温度)为, 95℃ 4 min; 98℃ 10 s, 55℃ 10 s, 72℃ 2 min, 30个循环; 72℃ 10 min。琼脂糖凝胶电泳后切胶回收, 回收产物重组到pDONR201载体并转化大肠杆菌, PCR鉴定并测序验证。用DNAMAN软件比对分析测序结果, 将正确的克隆重组到相应的GFP载体pN-GFP和RNAi载体pB7GWIWG2(II)。

用基因枪介导法将目标基因载体pN-GFP- OsBAK1L 转化至洋葱表皮细胞中, 以不含目的基因的空载体pN-GFP为对照, 用激光共聚焦显微镜观察^[15]。

拟南芥 AtSERK1-5 基因家族的氨基酸序列来自http://www.uniprot.org/, 水稻 OsBAK1L 基因的氨基酸序列来自http://www.gramene.org/。利用MEGA 5.0进行多序列比对, 利用BioEdit 7.1.6.0进行序列注释^[16]。利用DNAMAN对LOC_Os03g49620基因座上 OsBAKL/ LOC_Os03g49620.4和 OsSERKL8 的氨基酸序列比对。

将pB7GWIWG2(II)- OsBAK1L 热击转化农杆菌EHA105, 农杆菌介导转化9804- Rxo1 的水稻愈伤组织, 以除草剂(50 mg L^-1)筛选阳性愈伤组织, 进而再生获得转基因植株^[17]。

为验证转基因阳性再生植株。取水稻再生植株叶片, 以CTAB法提取DNA, 水溶解后贮存于-20℃冰箱备用。根据除草剂基因设计引物BarF/R, PCR扩增731 bp的片段。根据载体启动子35S序列和特异干扰片段序列, 分别设计正向和反向引物35S和RiBR, PCR扩增1000 bp的片段, 用于鉴定阳性转基因植株。pB7GWIWG2(II)- OsBAK1L 和9804- Rxo1 的DNA、pB7GWIWG2(II)分别作阳性和阴性对照。1.0%琼脂糖凝胶电泳, 成像观察。

种植转基因苗的同时, 种植9804- Rxo1 和9804, 分别作为阳性和阴性对照。待水稻孕穗期采用针刺法接种, 每株选取3个分蘖每个分蘖选2片生长正常叶接种^[18]。在主脉两侧接种6次, 接种点间隔3~5 cm。接种后每天喷雾保湿, 并观察记录表型变化。接种后24、48、72、96和120 h取样, 迅速用液氮冷冻并贮存于-80℃冰箱备用。

根据TRIzol试剂操作手册提取水稻组织的总RNA, DNase I处理后, 取约1~2 μg的总RNA用于cDNA第一链的合成, -20℃保存待表达分析。

以水稻 Actin (Os03g0718100)作为内参, ActinF/ R为引物半定量PCR扩增后, 调整反应体系, 均一化反应浓度。用目的基因特异引物RTBF/R检测转基因植株中 OsBAK1L 基因的表达, 以ActinF/R的PCR扩增产物为对照。用1.0%琼脂糖凝胶电泳, 成像观察。

植物过敏性坏死反应基因 OsMPK13 设计引物RTMPK13F/R, PCR扩增检测引物稳定后用于荧光定量PCR分析, Actin (Os03g0718100)作为内参, ActinF/R为引物荧光定量PCR做为对照。荧光定量PCR参照TaKaRa说明书DRR041A。

Gramene数据库LOC_Os03g49620.4注释为BRASSINOSTEROID INSENSITIVE 1-associated receptor kinase 1 precursor, 因此, 将该基因暂命名为 OsBAK1L 。用引物OEBF/R扩增9804水稻的cDNA片段, 与数据库(http://www.gramene.org/)中LOC_Os03g49620.4的CDS编码序列一致, 共1815 bp (图2)。

根据NCBI在线BLAST对 OsBAK1L 同源序列分析, 选择其中540 bp特异核苷酸序列5'-GGTGA GGAGGTGAAGTGGGAGAGGCGGCGTGGACCTGCGACGACCTGCTTGCTGCCCAGCCTGCGAGGGCAAGCCACTGGTAGGTGCCATACTGGACTGGCTTGCTTGTTAACTGGGTTAGCCAGGGACTCCGGTATTATACTACTATGATCAGTTCGTGTACTTTTTTTCG

CCGGGCAAGTTTCCCCAAGGAACTCTTTTGATGCTGTAATTATAACTGAAGAGTCATGGATCTGCTCAGCGTCCTCCTAATTATAGCATCTCTGCTCCCATTTTCAGCATCTGACCGTCAAGGTGATGCACTATATGATATGAAGCTGAAGCTGAATGCTACTGGTAACCAGCTTTCTGACTGGAACCAAAATCAAGTTAACCCATGCACTTGGAATTCTGTTATTTGTGACAACAACTACAATGTTGTGCAAGTAACATTGGCATCTATGGGATTCACTGGAGTTCTATCACCACGAATTGGAGAGCTTCAGTTTTTGAATGTTTTGTCCTTGCCTGGTAATAAGATTACTGGTGGCATACCTGA GC-3'

作为RNAi干扰区段。用引物Att-RiBF/R扩增 OsBAK1L 干扰区段序列, 共540 bp。以Gateway技术将扩增片段导入pDONR201载体, 经测序验证RNAi干扰区段导入pB7GWIWG2(II)构建RNAi载体(图2)。

图2

Fig. 2

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	图2 构建 OsBAK1L 基因GFP和RNAi载体上图: 构建的 OsBAK1L 基因的GFP载体测序结果, 下图: pDONR201载体测序结果; 两边是载体序列, 方框内是目的基因片段。.Fig. 2 Construction of GFP and RNAi vector of OsBAK1LUpside: sequence result of OsBAK1L ; Downside: sequence result of OsBAK1L ’s RNAi sequence. Vector boundary sequences is on the both sides, the gene sequence is in the middle box.

用基因枪将pN-GFP- OsBAK1L 载体转化洋葱表皮细胞, 其中pN-GFP空载体作为阴性对照。亚细胞定位显示GFP-OsBAK1L融合蛋白定位在细胞膜(图3)。

图3

Fig. 3

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	图3 OsBAK1L亚细胞定位1: 暗场; 2: 明场3: 融合; pN-GFP: 对照定位结果; OsBAK1L-GFP: OsBAK1L定位结果。Fig. 3 Subcellular location of OsBAK1L1: dark field; 2: bright field; 3: merge; pN-GFP: check; OsBAK1L-GFP: subcellular location of OsBAK1L-GFP．

将水稻基因 OsBAK1L 的氨基酸序列与拟南芥 SERK1-5 基因家族成员的氨基酸结构比对发现: 它们结构类似, 都具有信号肽、亮氨酸拉链、LRR结构、跨膜域和膜内RD激酶域, 但OsBAK1L在LRR C-末端结构域上不含有SPP模体(图4)。由于SERK家族成员是以SPP模体作为分类标志, 所以OsBAK1L不属于SERK家族成员。

图4

Fig. 4

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	图4 OsBAK1L结构分析序列比对中保守氨基酸用阴影标注, 黑线上的氨基酸是SPP模体。Fig. 4 Analysis of OsBAK1L’s structureIn the alignments, the conserve amino acids are shaded. The amino acids upside the blank line is gray, the SPP motif is underlined.

Singla等^[9]发现 OsSERKL1-9 中 OsSERKL8 的基因座位号与 OsBAK1L 相同, 均为LOC_Os03g49620。将 OsSERKL8 和 OsBAK1L 的DNA、cDNA和氨基酸序列比对, 发现两者DNA序列一致, 但cDNA和氨基酸之间均存在差异。两者主要差异是 OsSERKL8 的CDS序列5°端部分序列缺失, 致使OsSERKL8肽链中无信号肽和LRRNT结构域(图5), 两者可能是同一基因位点不同的转录形式。

图5

Fig. 5

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	图5 OsBAK1L和OsSERKL8 氨基酸序列比对黑点显示OsSERKL8缺失的氨基酸。Fig. 5 Amino acid sequence alignment between OsBAK1L and OsSERKL8Black dots indicate the lack segment of OsSERKL8’s amino acids.

利用农杆菌EHA105转化水稻9804 -Rxo1 的愈伤组织, 经除草剂筛选后获得58个转化体, 其中9个转化体再生转基因苗, PCR检测确认1个阳性转化体共9株。

根据载体启动子35S序列和特异干扰片段序列, 分别设计正向和反向引物35S和RiBR。它们和载体 Bar 基因引物BarF/R分别扩增转基因阳性植株、9804- Rxo1 、pB7GWIWG2(II)- OsBAK1L 质粒和pB7G WIWG2(II)。其中只在阳性植株和pB7 GWIWG2(II)- OsBAK1L 获得35S和RiBR的 1000 bp目的片段。此外, Bar 基因检测结果发现, 只在9804- Rxo1 没有扩增出731 bp的目的片段(图6-A)。

图6

Fig. 6

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图6 OsBAK1 -RNAi转基因苗PCR鉴定和 OsBAK1L 基因 表达分析A: 上部是载体35S启动子引物和目的基因引物扩增 OsBAK1L -RNAi片段; 下部是扩增选择标记 Bar 基因。 T: OsBAK1L -RNAi转基因阳性苗; C: 9804- Rxo1 ; V+: pB7GWIWG2(II)- OsBAK1L 质粒; V: pB7GWIWG2(II)。B: OsBAK1L 表达分析; 1~5: 分别是接细菌性条斑病菌Rs105后24 h、48 h、72 h、96 h、120 h的T0转基因植株; C: 9804- Rxo1 。Fig. 6 Identification of the OsBAK1 -RNAi transgene rice plants by PCR and the expression of OsBAK1LA: upside shows amplification of the segment of OsBAK1L -RNAi by 35S and OsBAK1L as forward and reward primers; down side shows PCR of Bar gene.T: transgene rice of OsBAK1L -RNAi; C: 9804- Rxo1 ; V+: pB7GWIWG2(II)- OsBAK1L ; V: pB7GWIWG2(II). B: semi-quantitative PCR analysis of OsBAK1L ; 1-5: T0 transgenic rice of OsBAK1L -RNAi at 24 h, 48 h, 72 h, 96 h, 120 h after inoculating X. o . pv. oryzicola Rs105, respectively; C: 9804- Rxo1 .

用干扰的目的基因引物RTBF/R和 Actin 引物ActinF/R扩增。RNAi转基因植株与抗病对照相比, OsBAK1L 基因的表达量下降(图6-B)。

孕穗期接种细菌性条斑病菌后连续2周观察发病情况。抗病品种9804- Rxo1 接种4 d后出现过敏性褐色坏死反应, 第5天病斑更加明显且停止进一步扩展。转基因植株第4天侵染点坏死干枯, 没有水浸状细条形病斑出现, 也没有像抗病品种9804- Rxo1 那样出现明显褐色HR反应。接种第5天出现明显过敏性褐色HR反应, 与抗病品种第4天HR反应病斑表型类似。感病品种9804第4天出现明显水浸状细条形病斑, 第5天感病品种细条形病斑扩展(图7-A)。

图7

Fig. 7

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图7 转基因植株接种细菌性条斑病菌的反应和抗病相关基因 OsMPK13 表达分析A: 转基因植株接种细菌性条斑病菌的反应; B: 抗病相关基因 OsMPK13 表达分析; S: 感病对照9804; R: 抗病对照9804- Rxo1 ; E: 转基因水稻。hpi: 接种后时间(h)。Fig. 7 Response of transgenic rice plants to inoculation with X. oryzae pv . oryzicola and the expression of resistance related gene OsMPK13A: phenotypes after inoculating with X. oryzae pv. oryzicola ; B: the expression of resistance related gene OsMPK13 ; S: susceptible control 9804; R: resistant control 9804- Rxo1 ; E: transgenic rice plantsi; hpt: hours post inoculation.

Song等^[19]发现 OsMPK13 / OsBIMK2 调控植物过敏性坏死反应, OsMPK13 过表达植株表现严重的细胞坏死反应, 而 OsMPK13 抑制表达植株细胞坏死反应减弱。因此, 本研究选择植物类受体激酶下游的基因 OsMPK13 进行实时定量RT-PCR分析, 感病植物中 OsMPK13 表达量几乎没有变化, 而且处于较低水平。转基因植株与抗病对照9804- Rxo1 相比, OsMPK13 表达变化与抗病表型变化趋势一致, 但是同一时间点转基因植株 OsMPK13 表达量比抗病对照低(图7-B)。