* 通讯作者(Corresponding authors): 刘永柱, E-mail:lively@scau.edu.cn; 陈志强, E-mail:chenlin@scau.edu.cn
第一作者联系方式: E-mail: guo.tao@vip.163.com, Tel: 020-38604903
**同等贡献(Contributed equally to this work)
Phenotype of the
叶色突变是一种常见的表型变异, 突变基因通过直接或间接影响光合色素的合成和降解, 最终影响植物的光合作用。已克隆的水稻叶色突变基因多数与叶绿素合成、降解和叶绿体发育相关。例如 OsYGL1编码的叶绿素合成酶催化叶绿素a的羧化反应, 该基因的突变导致突变体内四吡咯中间产物含量骤增、叶绿体发育迟滞[ 1]。此外, 也有少数水稻叶色突变基因是通过影响类胡萝卜素合成而间接影响叶绿素的合成和降解的。如类胡萝卜素合成相关酶基因 PDS、 ZDS、 CRTISO和 β-LCY突变会导致类胡萝卜素含量降低, 破坏光合系统, 降低叶绿素含量, 导致幼苗白化[ 2]。
本课题组通过空间诱变获得突变体 hfa-1, 该突变体在三叶期之前完全白化, 随后逐渐转绿, 并且伴随多分蘖矮秆表型。前期研究表明[ 3, 4], hfa-1的白化转绿、多分蘖矮秆表型受单隐性核基因 hw-1( t)控制, 通过图位克隆筛选出候选基因LOC_Os04g 57320, 该基因与拟南芥叶色花斑基因 im同源[ 5, 6]。 IM基因编码含线粒体交替氧化酶AOX结构的叶绿体蛋白, 通过参与叶绿体呼吸电子传递链, 在类胡萝卜素生物合成途经中调控八氢番茄红素脱氢酶PDS活性。类胡萝卜素生物合成是类异戊二烯合成途径中的重要分支, 其不同反应中间产物与众多次生代谢途径有关[ 7]。与 IM基因不同, hw-1( t)不但影响叶色, 还对株高、分蘖等其他表型性状产生重要影响, 暗示在单子叶植物中存在不同的调控机制。近年来越来越多证据表明多分蘖矮秆表型与新发现的植物激素独脚金内酯有关[ 8, 9]。 hw-1( t)作为调控独脚金内酯合成前体类胡萝卜素的基因, 或许通过直接影响类胡萝卜素含量而间接影响水稻独脚金内酯合成, 从而调控植株形态构成。
本文对 hfa-1突变体叶色白化转绿过程中的类胡萝卜素生物合成途径及与该途径有关的植物激素代谢途径的相关基因进行表达分析。在此基础上, 通过基因芯片技术分析 hfa-1突变体在白化、转绿2个时期的基因表达谱, 从整体水平上研究其代谢机
制和差异基因的功能, 为深入阐述 hw-1( t)调控矮秆多蘖、白化转绿特异表型的机制奠定基础。
2003年利用返回式卫星搭载美国光身稻品种Francis干种子于太空飞行18 d (卫星倾斜角度63°, 近地距离和高地距离分别为175 km和320 km, 辐射剂量为2.656 mGy)。将空间诱变种子与对照一起萌发, 移植M1代单株, 成熟时收获单株主穗, 混合主穗种子得到M2代种子。移植M2代单株, 常规田间管理, 在M2群体中发现一株白化转绿、多分蘖矮秆突变体。经过连续4代的自交繁殖获得稳定突变株系, 命名为 hfa-1。Francis为野生型(WT, wild-type)。
将 hfa-1与野生型盆栽于人工气候箱中(光暗12 h / 12 h、温度25℃、湿度80%), 分别于二叶期、四叶期取样, 每品种每次混取5株叶片(约200 mg), 3次重复。然后迅速放入液氮冷冻, 置-70℃冰箱保存备用。
用半定量RT-PCR方法, 分析已知水稻类胡萝卜素、GA、ABA和SL生物合成途径部分相关基因在 hfa-1和野生型之间的表达差异。各组织总RNA提取方法见文献[4]。以突变体和野生型叶片的第一链cDNA为模板, 应用引物组合进行PCR扩增, 琼脂糖凝胶电泳检测(引物信息见表1)。PCR程序为: 94℃ 2 min; 94℃ 30 s, 58℃ 30 s, 72℃ 30 s, 共30个循环; 最后72℃延伸7 min, 同时设定 actin为内部参照。通过调整模板浓度, 使各时期材料中 actin的PCR扩增产物量一致。
同时用定量QRT-PCR分析上述基因在 hfa-1突变体和野生型之间的表达差异。采用2×SYBRGreen master mix荧光染料, 25 μL PCR体系, 设3次重复, 荧光PCR反应在CORBETT6200定量PCR仪上进行。程序为95℃ 30 s预变性, 之后95℃ 5 s, 58℃ 30 s, 72℃ 30 s, 共40个循环, actin为内参, 应用2-ΔΔCT [ 10]的方法计算基因表达量的相对变化(引物信息见 表2)。
使用Affymetrix公司水稻基因组芯片(GeneChip Rice GenomeArray), 覆盖约51 279个转录本, 代表2种水稻品系, 其中大约48 564个粳稻转录本和1260个籼稻转录本, 芯片内2次重复。序列信息来源于NCBI UniGene Build #52 (May 7, 2004)、GenBank和TIGROs1 v2 data set (ftp.tigr.org, FASTA, 89.3 MB)。芯片杂交工作由博奥生物芯片有限公司——生物芯片北京国家工程研究中心完成。杂交工作基本流程详见GeneChip Expression Analysis Technical Manual。使用Affymetrix GeneChip Scanner 3000扫描芯片, 及Affymetrix GeneChip Operating Software Version 1.4 (GCOS 1.4)分析软件分析芯片图像, 把图像信号转化为数字信号, 并用dChip软件做校正和归一化处理。
选取2次重复表达差异两倍基因(即log2Ratio ≥ 1或log2Ratio ≤-1)为显著差异的探针。通过Cluster 3.0对 hfa-1与野生型在2个时期的差异表达探针及各样品中有效的检测信号值进行聚类分析, 采用Hierachical、Average linkage、K-means算法进行聚类, 分析芯片的重复性, 并在整体上分析全部基因的表达模式。对于筛选出的基因, 利用分子功能注释系统MAS3.0的基因组数据库(http://www.capitalbio.com/zh-hans/support/MAS), 根据每个基因的TIGR登录号寻找对应的功能注释。对于未知功能或未被注释为基因的序列, 使用TIGR Plant Trans cript Assemblies工具(http://plantta.tigr.org/)查找最长序列, 然后用NCBI blastX工具进行序列比对, 找出同源性最高的大麦、水稻、玉米以及拟南芥基因, 从而推测其功能, 并依此分类。
由于 hw-1( t)同源基因(拟南芥 IM和番茄 PTOX)的分子功能都涉及到类胡萝卜素生物合成途径, 利用RT-PCR和QRT-PCR检测了 hfa-16个类胡萝卜素生物合成基因在不同时期(二叶期和四叶期)的表达差异(WT为对照)。6个基因分别是八氢番茄红素脱氢酶基因 OsPDS、ζ-胡萝卜素脱氢酶基因 OsZDS、类胡萝卜素异构酶基因 OsCRTISO、番茄红素环化酶基因 OsLCY、八氢番茄红素合成酶基因 OsPSY1和 OsPSY2。
RT-PCR分析结果(图1-A)表明, hfa-1在二叶期(白苗期)和四叶期(转绿后)的基因表达具有较大差异, 二叶期 OsPSY1和 OsLCY的表达水平低于野生型; 转绿后6个基因的表达和野生型无明显差异。QRT-RCR表明, hfa-1二叶期类胡萝卜素合成相关基因的mRNA转录水平仅为野生型的一半左右(图1-B); 植株转绿后, hfa-1各相关基因的表达量上调并基本恢复至野生型水平, 其中 OsPSY2、 OsPDS、OsZDS和 OsCRTISO的mRNA转录水平甚至高于WT (图1-C)。上述结果表明 hw-1( t)基因抑制了二叶期 hfa-1类胡萝卜素的生物合成。
类胡萝卜素的生物合成涉及多种植物生长发育激素, 如赤霉素(GA)、脱落酸(ABA)和独脚金内酯(SL)等。在二叶期(白化)和四叶期(转绿) 2个时期, 对参与GA生物合成基因 OsCPS1(柯巴焦磷酸合成酶)和 OsKS1 (内根-贝壳杉烯合成酶)、ABA生物合成基因 OsZEP1 (玉米黄质环氧化酶)和 OsNCED1 (9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶)、SL生物合成基因 OsCCD7(胡萝卜素裂解双加氧酶)和SL信号传导基因 OsD3(含LRR与F-box结构域蛋白酶)进行表达分析(图2)。RT-PCR结果表明, 与WT相比, hfa-1中参与GA代谢途径基因 OsKS1, ABA代谢途径基因 OsZEP1、 OsNCED1和SL代谢途径基因 OsCCD7、Os D3在白化时期的表达均明显下调。转绿后, hfa-1多个基因表达上调, 除 OsNCED1和 OsD3外, 其余基因的表达量与野生型接近。QRT-PCR结果也表现了同样趋势, hfa-1各基因的表达水平在白化时期仅为野生型的5%~88%, 其中 OsZEP、OsCCD7和 OsD3的表达量分别比野生型下降40%、95%和40%; 转绿后, 除 OsD3基因表达量仍为WT的40%, 其余基因的表达量均接近野生型。上述结果说明 hw-1( t)基因对GA、ABA和SL代谢途径产生影响, 特别是对 OsD3基因表达具有长期的抑制作用。
在二叶期(白化)、四叶期(转绿后)分别提取 hfa-1和野生型RNA进行水稻叶片组织的基因表达谱变化分析, 样品的RNA和芯片质量检测结果见表3。提取的总RNA完好, 28S∶18S rRNA条带亮度大
于或接近2∶1, A260/ A280比值和RNA总量均分别大于1.8 µg和15.0 µg。芯片杂交的Oligo B2、Poly-A等阳性对照信号及3/5比值正常, 基因检出率处正常范围, 这些检测结果显示芯片结果可用于后续分析。F1、F2代表野生型二叶期和四叶期; H1、H2代表 hfa-1二叶期(白化)和四叶期(转绿后)。
图3显示了57195个表达探针的芯片信号强度在 hfa-1突变体和野生型不同时期(二叶期、四叶期)的差异变化。可见, 在野生型(F2/F1)或突变体(H2/H1)中, 绝大部分基因表达水平差异均不明显(黑色部分)。以二叶期(白化)为参比, hfa-1突变体转绿后上调表达的探针数目较多(红色区域较大), 而下调表达的探针数目较少(绿色区域较小), 这与野生型情况恰好相反。
根据荧光强度比值, 分别筛选同一品种在不同时期间的差异基因。选择表达差异两倍基因(即log2Ratio≥1或log2Ratio≤-1)为显著差异的探针, 共涉及4 361个探针。通过Cluster 3.0对 hfa-1与野生型在2个时期的差异表达探针进行聚类分析, 结果见图4-A。由于 hfa-1在白化与转绿2个时期间差异表达的基因源于两方面, 即由 hw-1( t)突变引起的在2个时期表达量不同的基因, 和水稻品种自身发育而差异表达的基因。因此, 需要从 hfa-1和野生型两组所有差异表达探针中, 筛选出变化趋势相异的探针, 即图中Down和Up所示部分(图4-A)。与白化时期相比, hfa-1在叶色白化转绿过程中表达上调的探针数为868组, 下调探针数为576组, 共1444组(图4-B)。
对筛选的差异表达基因进行功能注释和分类。利用分子功能注释系统MAS3.0的基因组数据库(http://www.capitalbio.com/zh-hans/support/MAS), 根据每个基因的TIGR登录号寻找对应的功能注释。功能注释结果显示, 大约60%的基因可通过系统进行功能分类。这些差异表达基因广泛参与了水稻生理、发育、细胞、代谢、催化、蛋白结合以及外源应激等生理生化过程。进一步分析可知, 在 hfa-1叶色白化转绿过程中, 差异表达上调基因与下调基因在功能模式上差异较大(图5)。其中, 表达下调基因主要与转录因子、谷胱甘肽转移酶(抗氧化)和核苷酸活性等分子功能有关, 涉及生理过程主要有内源刺激物和抗逆胁迫响应等方面。
通过KEGG数据库对 hfa-1叶色白化转绿过程中差异表达基因进行Pathways分析(表4), 结果显示 hfa-1在2个时期差异表达基因涉及光合作用、碳固定和氮代谢等多个反应通路, 所涉及基因数为2~17个。在各反应途径中, 以光合作用通路最为显著, 有多个基因的表达发生很大变化, 这些基因与该通路中的光反应中心、聚光色素复合体、细胞色素和辅助因子等蛋白复合体组分合成代谢有关(表5)。此外, 在该通路中除V-ATPase基因外, 其余基因表达均上调。V-ATPase是液泡化型H+-ATP合成酶, 其主要作用是利用ATP水解产生的能量, 将质子从真核细胞类囊体内跨膜转移到体外, 形成膜间质子梯度[ 11]。V-ATPase基因表达下调, 可使H+转运到细胞质的数量减少, 降低ATP能量消耗, 从而尽量满足类囊体内光合作用增强所需。
对差异表达基因进一步进行光合作用Pathway构建, 由图6可知, 该通路中的两个光反应中心PSI和PSII、细胞色素Cytb6/f、ATP合成酶以及辅助因子等蛋白复合体组分合成基因多为上调表达。Cytb6/f复合体是一种存在于类囊体膜间的蛋白质, 主要催化PQH2氧化和PC还原, 并把质子从类囊体膜间质中跨膜运输到膜内腔中。通过查询水稻基因芯片探针数据库(http://www.ricechip.org/), 获得与Cytb6/f复合体组分有关的水稻基因芯片探针7个, 其功能注释仅涉及PetA、PetB、PetC和PetD。进一步对这些探针在 hfa-1与野生型中的表达进行分析(表6), 与野生型相比, hfa-1在白化转绿过程中参与Cytb6/f复合体组分合成的相关基因表达均明显上调, 其差异表达倍数比野生型高出0.29~4.90倍。此结果暗示, 在 hfa-1叶色白化转绿过程中, 很有可能存在通过提高Cytb6/f蛋白复合体活性替代 hw-1( t)基因功能以调节电子传递和质醌库还原氧化的机制。
为了验证基因芯片的结果, 以定量RT-PCR分析 hfa-1和野生型在二叶期(白化)、四叶期(转绿后)的类胡萝卜素及植物激素生物合成相关基因, 与基因芯片结果进行相关性分析(图7)。结果显示, 定量RT-PCR结果与基因芯片两样本间相关系数为0.409, 达显著水平, 表明两者趋势基本一致。在进行定量RT-PCR的26个基因差异表达结果中有20个结果与芯片实验结果相近, 仅其余6个结果差异较大, 这可能是因为RT-PCR方法为定量, 而基因芯片方法是定性, 两者在信号强度和基因转录丰度上线性关系拟合度不高。
前期研究表明 hw-1( t)与拟南芥叶色花斑基因 im同源。拟南芥 IMMUTANS( IM)基因突变引起的叶片花斑是目前研究最为深入的一类植物叶色突变, 早在孟德尔遗传学时期就发现此类突变[ 12]。拟南芥 im突变体于1963年首次被分离鉴定, 研究结果显示 im突变体属隐性核遗传突变体, 具有白绿相间的嵌合叶色表型[ 13, 14, 15]。通过图位克隆和转座子标签法, 拟南芥 IM基因被成功克隆[ 16, 17, 18]。在番茄中, IM的同源基因 PTOX突变导致部分叶片白化, 并造成果实缺乏类胡萝卜素[ 19, 20]。与拟南芥及番茄相比, hw-1( t)由于碱基突变导致蛋白质翻译提前终止, 形成不具备功能的残缺多肽。推测 hw-1( t)可能对类胡萝卜素及其次生代谢途径造成显著影响。
高等植物类胡萝卜素生物合成的前体是含有CS的异戊二烯焦磷酸(IPP)[ 21]。IPP在IPP异构酶(IPPI)、垅牛儿基焦磷酸合成酶(GGPS)、八氢番茄红素合成酶(phytoenesynthase, PSY)的催化下形成八氢番茄红素(Phytoene)[ 22]。八氢番茄红素在八氢番茄红素脱氢酶(PDS)、ξ-胡萝卜素脱氢酶(ZDS)和类胡萝卜素异构酶(CRTISO)催化下形成番茄红素(Lyeopene)[ 23]。番茄红素由番茄红素β-环化酶(β- LCY)和番茄红素ε-环化酶(ε-LCY)共同催化生成α-胡萝卜素[ 24], 进一步由酶催化形成含氧类胡萝卜素。类胡萝卜素在类胡萝卜素裂解双氧合酶(Carotenoid cleavage dioxygenase, CCD)作用下生成多种生物活性物质, 如ABA、SL、植物生长调节因子等[ 25]。八氢番茄红素去饱和环化反应是类胡萝卜素生物合成的关键环节, hw-1( t)基因的突变有可能导致二叶期八氢番茄红素去饱和途径电子传递受阻, 造成类胡萝卜素合成减少, 缺少类胡萝卜素保护的叶绿体被单线态氧破坏, 产生叶片白化表型。本研究中类胡萝卜素相关基因的表达结果证实了上述推测, hfa-1二叶期类胡萝卜素合成相关基因的mRNA转录水平仅为野生型的一半左右, 而四叶期各相关基因的表达量上调并基本恢复至野生型水平, 这与 hfa-1二叶期白化、四叶期复绿的表型是相符的。
由于类胡萝卜素是多种激素合成的前体, 推测 hw-1( t)基因可能对赤霉素、脱落酸和独角金内酯代谢途径产生影响。本研究中, hfa-1中参与GA代谢途径基因 OsKS1, ABA代谢途径基因 OsZEP1、 OsNCED1和SL代谢途径基因 OsCCD7、OsD3在白化时期的表达均明显下调, 此结果与前人对拟南芥 pds突变体的研究报道相似[ 26]。拟南芥T-DNA突变体 pds编码八氢番茄红素合成酶的 PDS基因发生变化, 其植株叶片出现白化, 叶绿体发育受阻, 同时植株矮化。对 pds突变体类胡萝卜素及其相关代谢途径分析发现, 涉及类胡萝卜素、叶绿素和赤霉素生物合成基因的表达均受抑制[ 27]。通过两结果的比较, 可推测 hw-1( t)基因的作用机制与 PDS基因相类似, 即通过反馈机制对不同次生代谢途径的基因表达产生影响。但 hw-1( t)突变对其他表型的影响与拟南芥和番茄不尽相同, 最明显的区别在于拟南芥和番茄没有出现多分枝现象。造成这种差异的原因可能是单子叶植物与双子叶植物进化差异; 此外, hfa-1四叶期(转绿后)多个基因表达量与野生型接近, 但 OsD3表达量仍然较低, 这暗示 hw-1( t)基因对SL的信号传导具有长期的抑制作用, 而SL传导受阻将减少对分蘖芽的抑制, 从而产生多分蘖的表型。综上所述, 除类胡萝卜素生物合成外, hw-1( t)及其同源基因在水稻的发育中具有更广泛的作用。
对 hfa-1叶色白化转绿过程的调控基因进行筛选, 发现大多数在白化时期相对表达量较高的基因均与蛋白翻译、细胞分裂以及抗逆胁迫相关。 hfa-1在二叶期由于叶片白化、光合色素含量低而不能进行有效的光合作用, 导致植株体内的代谢物质和能量缺乏, 而这些与蛋白翻译、细胞分裂以及抗逆胁迫有关基因的表达上调, 有利于协调胁迫应激的解除和幼苗快速生长。其中, 参与Cytb6/f复合体组分合成的相关基因表达均明显上调, 其差异表达倍数比野生型高出0.29~4.90倍。Cytb6/f复合体作为连接光系统PSII和PSI的中间电子载体, 能均衡两个光系统间的电子传递。当一个光系统受损时, 能使另一光系统的电子传递仍然进行, 并使多个PSII复合体与质醌库联系, 使类囊体膜上的电子传递成网络式[ 28, 29, 30, 31]。在 hfa-1叶色白化转绿过程中, 很可能存在通过提高Cytb6/f蛋白复合体活性替代 hw-1( t)基因功能以调节电子传递和质醌库还原氧化的机制。
此外, Miura等[ 31]对拟南芥 im突变体绿白嵌合叶片的绿斑部分与野生型绿色叶片进行基因表达谱比较, 发现 im突变体叶片绿斑部分的光合基因表达并未发生明显的变化, 而与细胞壁合成相关基因却显著下调, 认为这可能与向白斑部分转运更多的蔗糖或己糖, 以维持白斑部分生长有关。但本研究的差异表达基因Pathways分析结果显示, hfa-1叶色白化转绿过程中差异表达基因主要涉及光合作用、碳固定和氮代谢。从能量供应的角度看, 这3种代谢途径是能够相互转化和调节的。在 hfa-1叶色白化转绿过程中涉及3种代谢途径的大多数基因表达上调, 可促进突变体植株体内对营养物质的摄取和能量的储存。然而, 要探讨这些代谢途径相关基因的表达是否与 hfa-1突变体特异表型相关, 还需进一步的实验验证。
类胡萝卜素、植物激素(GA、ABA和SL)生物合成相关基因在 hfa-1突变体白化期叶片中表达量减低, 表明 hw-1( t)基因的突变抑制了苗期类胡萝卜素合成, 同时还对涉及该过程相关多个次生代谢途径产生影响。 hfa-1叶色白化转绿过程中上调和下调表达基因涉及的生理过程主要是光合作用、内源刺激物及抗逆胁迫的响应等。差异表达基因显著涉及光合作用通路, 且电子传递体Cytb6/f复合蛋白合成相关基因在 hfa-1叶色白化转绿过程中上调表达明显, 推测Cytb6/f蛋白复合体在电子传递和质醌库还原氧化上对 hw-1( t)起补偿功能。