小麦与玉米杂交产生小麦单倍体与双单倍体的稳定性
陈新民*, 王凤菊, 李思敏, 张文祥
中国农业科学院作物科学研究所, 北京 100081
* 通讯作者(Corresponding author): 陈新民, E-mail:chenxinmin@caas.cn
摘要

小麦与玉米杂交是诱导小麦单倍体最有效的途径之一, 但单倍体和双单倍体产生频率不稳定影响了该技术的应用。选用13个小麦杂种F1代单交组合与玉米杂交, 研究了不同小麦生长环境、生长素处理、培养基和壮苗处理对单倍体及双单倍体产生频率的影响。小麦生长在大田, 去雄后割穗培养与玉米杂交平均得胚率为23.9%, 每个杂交穗平均得胚数6.8个, 均是返青后从大田移回冷温室盆栽的3倍以上; 不同小麦杂交组合间胚产生频率存在明显差异。生长素Dicamba蘸穗处理平均得胚率是21.5%, 与2,4-D处理得胚率(21.1%)无显著差异, 但不同杂交组合间差异显著。B5培养基幼胚萌发率为70.9%~88.3%, 平均82.0%; 1/2 MS培养基胚萌发率为70.0%~86.0%, 平均76.6%; 两种培养基平均胚萌发率无显著差异。试管苗经壮苗培养基壮苗处理与试管苗经移栽壮苗处理后加倍效率分别是67.6%和8.6%。移栽壮苗处理的苗分蘖少, 生长较弱, 加倍处理后存活率低和加倍率低是其单倍体加倍效率低的原因。

关键词: 小麦×; 玉米; 单倍体; 激素处理; 培养基
Stable Production of Wheat Haploid and Doubled Haploid by Wheat × Maize Cross
CHEN Xin-Min*, WANG Feng-Ju, LI Si-Min, ZHANG Wen-Xiang
Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China
Abstract

One of the most effective ways to produce wheat haploid is the method of crossing wheat with maize. However, the problem of unstable frequencies in haploid and doubled haploid production affects its application. In this study, 13 wheat F1 hybrids crossed with maize to explore the effects of wheat growth condition, hormone treatment, culture medium, and strong seedling treatment on production of haploid and doubled haploid. The frequency of embryo formation was 23.9% and the number of embryos per spike was 6.8 for the wheat plants grown in filed and then detached before pollination and hydroponically cultured after pollination. The efficiency of this method was three times higher than that of the method with plants transplanted into pot after green recovering in early spring and then grown in the unheated greenhouse condition. Embryo formation frequencies were obviously different among wheat crosses. There was no significant difference in the frequency of embryo formation between treatments of dipping spike with Dicamba (21.5%) and 2,4-D (21.1%). However, wheat cross had significant effect on embryo formation. The mean frequency of embryo germination on B5 medium was 82.0%, ranging from 70.9% to 88.3%, whereas averaged frequency of embryo germination was 76.6% on 1/2 MS medium, ranging from 70.0% to 86.0%. There was no significant difference between the two culture media in embryo germination. The efficiency of doubled haploid production for the seedlings treated with culture medium and transplanted into pot was 67.6% and 8.6%, respectively. Most of seedlings transplanted into pot had no tiller and grew weakly; this is the reason for low frequency of survival plant and very low frequency of doubling after colchicine treatment.

Keyword: Wheat ×; maize cross; Haploid; Hormone treatment; Culture medium

小麦与玉米杂交, 因玉米染色体与小麦纺锤体的不亲和性, 杂合子在最初的几次细胞分裂中会使玉米染色体全部丢失, 产生仅有小麦21条染色体的单倍体, 经过幼胚培养获得单倍体苗, 再经染色体加倍, 就可获得纯合双单倍体DH (doubled haploid)[ 1, 2]。用这种方法产生单倍体有3个优点: 第一, 由于玉米对小麦可交配 Kr基因的不敏感, 杂交得胚率远高于小麦×球茎大麦[ 3, 4]; 第二, 单倍体的产生对于小麦基因型无严格的选择性, 不同基因型的小麦均能获得单倍体[ 2, 5, 6, 7], 特别是花药培养不能产生愈伤组织或植株的小麦基因型, 在小麦×玉米中具有较高的胚和植株产生率[ 8], 这一点优于小麦花药培养; 第三, 无白化苗产生, 无体细胞变异, 较易得到稳定的纯合单倍体, 这对于遗传研究有重要价值。单倍体育种可缩短育种年限, 提高育种效率。小麦与玉米杂交, 在杂交的当年就可获得纯合双单倍体, 再经一个生长季的种子繁殖就可参加产量鉴定试验, 比常规杂交育种可缩短3~4年, 特别对于一年一季的冬小麦尤为重要; DH群体还是遗传研究和QTL定位研究的永久群体。因此, 该技术是产生小麦单倍体最有效的途径。自Laurie等[ 9]首次获得小麦×玉米单倍体植株后, 国内外许多学者均进行了有关研究并应用于育种实践[ 10, 11]。国外利用这种方法已培育许多小麦品种在生产上应用。如在加拿大, 从1997年开始利用DH育种技术, 至2011年已审定小麦品种25个, 其中23个是应用小麦×玉米DH技术培育的, 2009年DH品种种植面积占全国小麦面积的1/3[ 12]。我们从1992年开始小麦×玉米产生小麦单倍体和双单倍体的技术研究, 虽然在国内率先建立了利用小麦与玉米杂交产生小麦双单倍体技术体系, 并利用该技术首先培育了小麦新品种[ 13], 但是由于实验条件和一些技术方面的问题, 单倍体胚和植株产生频率以及单倍体加倍效率还不稳定, 在育种实际应用中存在一些问题。

本文旨在研究小麦生长环境条件、不同激素处理和不同培养基对小麦×玉米产生单倍体的影响及不同壮苗处理方法对单倍体加倍的效果, 为利用该技术稳定、高频率产生DH提供参考。

1 材料与方法
1.1 植物材料

2012年试验所用冬小麦杂种F1代13个组合(表1)均由中国农业科学院作物科学研究所小麦品质育种课题组组配, 玉米杂交种CRC1引自加拿大农业与农业食品部谷物研究中心(Cereal Research Centre, Agriculture and Agri- Food Canada)。

表1 不同生长条件下小麦×玉米得胚率 Table 1 Embryo Formation by wheat × maize method under different growing conditions
1.2 去雄授粉

玉米分期种植在温室, 小麦种植在大田。为了延长杂交时间, 在返青后将一部分组合从田间移回冷温室盆栽, 抽穗后选择开花前一天的小麦穗子去雄授粉。大田材料采用割穗培养法, 即于去雄次日9:00至10:00从基部剪穗, 在实验室中(20~23℃)授玉米花粉, 授粉后插入1/2 MS (含大量和微量元素)+8 mL L-1亚硫酸+20 g L-1蔗糖营养液, 并于16:00至17:00放入生长室, 培养条件为: 温度18~20℃, 相对湿度60%~70%, 光周期16 h光/8 h暗。授粉后1 d, 用100 mg L-1的2,4-D溶液蘸穗处理杂交穗一次; 授粉2 d后, 第二次蘸穗处理。每隔2 d更换一次培养液。对于盆栽材料, 去雄后第二天上午移至实验室授粉, 16:00至17:00将授粉后的材料放入生长室(生长条件同上)。授粉后1 d用100 mg L-1的2,4-D溶液蘸穗处理杂交穗一次, 授粉2 d后, 第二次蘸穗处理。

比较了2,4-D和Dicamba两种激素的效果, 其浓度均为100 mg L-1, 处理方法一致。

1.3 胚培养

授粉后14~16 d, 剥取籽粒, 在超净工作台上先用70%酒精表面灭菌30 s, 再用0.1%升汞灭菌10 min, 经无菌水充分冲洗3~4次后, 于解剖镜下剥出幼胚, 分别用1/2 MS培养基(含蔗糖2%, 琼脂7.5 g L-1)和B5培养基(含蔗糖2%, 琼脂10 g L-1)培养。接种后先在4℃冰箱中(黑暗)处理2~3 d, 然后放在室温黑暗条件下2 d, 最后在20~23℃、光周期16 h光/8 h暗条件下培养。

1.4 壮苗及春化处理

当幼苗生长到3~5 cm时, 将一部分幼苗转入壮苗培养基(1/2 MS+多效唑0.5 mg L-1+ IAA 0.2 mg L-1), 在11~15℃, 每日16 h光照条件下培养2周; 另一部分幼苗移栽至小花盆, 在相同温度、光照和60%湿度条件下生长2周, 每周施用适量稀释16倍的营养液(N∶P∶K= 20∶20∶20) 3次。当幼苗产生1~3个分蘖时, 在2~6℃春化处理1个月(光照16 h d-1), 再于壮苗生长环境下生长3~4 d, 最后进行加倍处理。

1.5 加倍处理

移出幼苗并剪掉根(留1~2 cm), 用0.2%秋水仙素溶液+DMSO (每10 mL加1滴), 在室温、黑暗、通气条件下处理3~4 h, 用自来水冲洗3~4 h, 然后移栽至壮苗生长环境下缓苗2周, 再逐渐升温, 抽穗后维持在18~22℃, 直到收获。抽穗时将所有植株的穗及时套上羊皮纸袋以防异交, 收获时调查结实率, 凡结实者为加倍成功者。

1.6 统计分析

对不同激素处理试验, 随机将每3个杂交穗混合, 为一个重复, 统计得胚率, 共3个重复, 数据经反正弦转化后再行统计分析。对不同培养基试验, 每个组合每种培养基6个重复, 每重复接种6~10个胚(因为不同组合的得胚率有差异), 按照随机区组试验统计分析。加倍处理效率(%)=结实植株数/加倍处理植株数×100。

2 结果与分析
2.1 不同生长条件对得胚率的影响

在返青时将小麦移栽至冷温室花盆, 这样比大田早抽穗7 d左右, 可多一周时间与玉米杂交。但盆栽与割穗培养两种条件下, 与玉米杂交得胚率存在明显差异(表1)。盆栽6个组合得胚率在5.8%~10.4%间, 平均7.8%; 每个杂交穗得胚1.0~2.5个, 平均1.8个。而割穗培养7个组合得胚率为12.5%~29.6%, 平均23.9%; 每个杂交穗得胚3.6~8.5个, 平均6.8个。小麦生长在大田, 去雄后割穗培养与玉米杂交, 平均得胚率和每个杂交穗平均得胚数均是盆栽的3倍以上。不同小麦杂交组合间胚产生频率存在明显差异。

2.2 不同激素处理对得胚率的影响

Dicamba和2,4-D处理对小麦与玉米杂交诱导单倍体胚频率无显著影响(表2)。Dicamba处理4个组合得胚率为16.2%~27.8%, 平均21.5%; 2,4-D处理胚产生率为6.0%~28.3%, 平均21.1%。但是Dicamba处理平均膨大颖果率(82.4%)显著高于2,4-D处理(58.5%)。不同杂交组合间胚产生频率存在显著差异, 以CA0998/CA0816组合最高(28.1%), 与CA0996/中麦175 组合 (24.2%) 差异不显著, 显著高于轮选987/CA0477 (20.5%)和CA0415/CA0391 (12.4%)组合。

表2 不同激素处理效应 Table 2 Effect of different hormone treatments
2.3 不同培养基对幼胚萌发率的影响

B5培养基平均胚萌发率是82.0%, 变幅70.9%~88.3%; 1/2 MS培养基胚萌发率在70.0%~86.0%间, 平均76.6%; 统计分析表明两种培养基平均胚萌发率无显著差异(表3)。不同杂交组合间平均胚萌发率差异显著, CA0998/CA0816组合萌发率最高 (87.2%), 显著高于组合扬麦16/扬麦15 (73.2%)和轮选987/CA0477 (73.3%), 与组合CA0415/CA0391 (79.2%)、CA0996/中麦175 (81.9%)和扬麦16/中麦895 (81.3%)差异不显著。

表3 不同培养基胚培养效果 Table 3 Effect of different culture media on embryo culture
2.4 不同壮苗处理方法对单倍体加倍效率的影响

壮苗培养基培养的幼苗经秋水仙素浸根加倍处理后, 存活率和加倍效率分别是92.0%和67.6%, 而经移栽壮苗处理的幼苗加倍处理后存活率和加倍效率分别是46.2%和8.6%, 前者分别是后者的2.0倍和7.9倍(表4)。试管苗经移栽壮苗处理后分蘖少, 生长较弱, 经加倍处理后不仅存活率低, 而且存活者加倍率低, 这是单倍体加倍效率低的原因。

表4 不同壮苗处理方法加倍效果 Table 4 Effect of different strong seedling treatments on doubling
3 讨论

小麦与玉米杂交诱导小麦单倍体后仅有极少部分胚有胚乳,而且胚乳总是异常并退化, 不能提供胚生长发育所需要的营养物质[ 1, 4], 如果不用生长素处理,让胚在植株上生长到胚培养时, 几乎所有的胚已退化消失[ 9]。因此, 生长素的处理对于维持单倍体胚生长到可以进行幼胚培养阶段必不可少。一般常用生长素2,4-D, 但也有人用Dicamba[ 14, 15]。Knox等[ 16]在硬粒小麦与玉米杂交中发现Dicamba处理较2,4-D处理得胚率显著提高, 但二者使用了不同浓度。在小麦与玉米杂交试验中未见Dicamba与2,4-D处理效果对比报道。本文对比试验表明, 在浓度均为100 mg L-1下, Dicamba处理较2,4-D处理显著提高了膨大颖果频率, 但这两种生长素处理单倍体胚产生频率无显著差异, 效果几乎相同。Dicamba 处理虽然膨大颖果率高, 但得胚率无差异, 这会增加剥胚工作量, 同时Dicamba价格是2,4-D的数倍。因此, 建议应用生长素2,4-D, 既经济又高效。

小麦生长条件对提高小麦与玉米杂交得胚率有重要作用。研究表明[ 17], 小麦在未通暖气的冷温室生长条件下与玉米杂交的平均得胚率(29.9%)显著高于大田生长条件下(3.6%), 其原因是两种环境下授粉时的温度、湿度、光照不同。大田小麦与玉米杂交时的温度、湿度、光照不可控制, 特别是遇到阴天、低温, 得胚率会显著降低。这也是大田不同季节或同一季节不同时间小麦与玉米杂交得胚率不稳定的重要原因。割穗培养比大田生长条件下能显著提高得胚率[ 18, 19, 20, 21]。本研究为了延长杂交时间, 在返青后将一部分小麦组合从大田移回冷温室盆栽, 抽穗后去雄与玉米杂交, 并与生长在大田授粉时割穗培养方法比较。割穗培养平均得胚率是盆栽的3倍以上, 虽然2种方法所用小麦组合多不相同, 但就相同的2个组合轮选987/中麦175和CA0996/中麦175 (正反交)而言, 割穗培养平均得胚率分别是27.2%和24.4%, 而盆栽者为10.4%和7.2%, 割穗培养远高于盆栽。2011年也得到相似结果(资料未列出)。两种方法授粉时和授粉后的温度、湿度、光照相同, 只是植株的生长状态不同。盆栽小麦植株分蘖少, 生长势弱于大田小麦, 可能其生理生化活性如内源激素水平、酶活性等也弱于大田小麦, 授粉受精能力较弱, 胚形成频率低; 而割穗培养植株生长健壮, 生理生化活性强, 授粉受精能力强, 有利于胚形成。因此, 盆栽和大田生长割穗培养两种方法得胚率之差异, 主要由小麦植株的生长状态引起。综上所述, 小麦生长环境条件和生长状态是小麦与玉米杂交稳定获得高频率单倍体胚的重要因素。国外一般将小麦和玉米均种植在人工气候室, 分期播种, 一年四季都可以杂交, 小麦生长环境条件如温度、湿度、光照、施肥等均可以控制且保持一致, 这样可以保证始终稳定获得高的得胚率。

小麦与玉米杂交幼胚培养一般采用1/2 MS培养基, 也有的用Difco Orchid琼脂培养基和B5培养基[ 2, 22]。本文比较了B5培养基与1/2 MS培养基幼胚培养效果, 虽然前者较后者胚培养萌发率提高5.4个百分点, 但二者差异不显著。在硬粒小麦与玉米杂交胚培养时也得到了相似结果[ 21]。因此, 在实际应用时可任选其一。

壮苗是提高小麦与玉米杂交单倍体植株加倍效率的关键[ 23]。此前我们是在6月至7月获得单倍体苗后, 放在4℃生长箱越夏处理3~4个月, 等气温降低后再移栽培育壮苗, 最后进行染色体加倍处理, 第2年夏季获得DH种子。为了当季就获得DH种子, 本文比较了壮苗培养基壮苗与移栽壮苗处理方法的加倍效果, 结果前者加倍处理后的存活率和加倍效率分别是后者的2.0倍和7.9倍。其原因是前者培养的壮苗分蘖多, 生长势强, 忍耐秋水仙素毒害能力强, 而后者壮苗效果差, 多数无分蘖, 生长势弱, 耐毒害能力差, 不仅加倍处理后存活率低, 而且存活的植株(可能不在最适加倍期)多数未能加倍结实。结合人工生长室, 在6月至7月获得单倍体苗后, 立即采用壮苗培养基进行壮苗处理, 再经人工春化处理, 在12月至翌年1月就可获得DH种子, 打破休眠后立即播种大田, 覆盖塑料布, 夏收即可获得DH繁殖的种子。秋播大田进行农艺性状和抗性鉴定, 筛选优异材料升入产量鉴定试验, 较常规育种提早3年。

在本实验室, 每获得1000个冬小麦DH株系, 按照现在平均每穗得胚6.8个、胚培养萌发率82%、加倍效率67%计算, 约需要268个小麦与玉米杂交穗。在北京从杂交到收获DH种子需要7~8个月, 并需人工生长室15 m2, 温室20~30 m2, 低温春化室15 m2。要实现育种上规模化应用, 可像加拿大农业与农业食品部谷物研究中心(Cereal Research Centre, Agriculture and Agri-Food Canada) DH实验室那样, 3个长期技工, 使用6~7个人工气候室, 一年四季均可杂交, 每年可生产15 000个DH株系。

The authors have declared that no competing interests exist.

作者已声明无竞争性利益关系。The authors have declared that no competing interests exist.

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