大肠杆菌( Escherichia coli)菌株DH5α由本实验室提供。酵母( Saccharomyces cerevisiae)菌株EBY100、pYD1载体、链亲和素磁珠及TRIzol试剂购自Invitrogen公司。pGADT7-Rec2载体及酵母培养所需试剂购自Clontech公司。其他生化试剂购自生工生物工程公司。

将pYD1和pGADT7-Rec2质粒分别用 EcoR I和 Xho I双酶切, 电泳分离酶切产物后, 回收pYD1载体骨架和pGADT7-Rec2载体酶切产物的114 bp长度片段, 经连接反应后转化大肠杆菌DH5α, 筛选阳性克隆并测序鉴定, 所获得的重组质粒命名为pYD1-Rec。

依据前期研究报道的方法克隆烟草 MYC2a基因^{[ 24]}, 然后用特异引物5'-AAAGGTACCGGGTC AGTCCCATTTTGGG-3'和5'-GCGCCTTGAGTCTTT ACTAAC-3'扩增 MYC2a基因的DNA结合域片段, 经 Kpn I酶切后, 克隆至由 Kpn I和 Eco I CRI双酶切的pYD1-Rec载体, 获得pYD1-MYC2a阳性对照载体。

在YPD固体培养基上画线活化酵母菌株EBY100, 并按照Clontech公司的酵母培养手册(Yeast Protocols Handbook)提供的方法挑取酵母菌落制备热激转化感受态。在进行常规酵母质粒转化时, 将0.3 μg质粒与30 μg鱼精DNA加入50 µL酵母感受态中, 混匀后加入6 µL DMSO和300 µL含40% PEG-4000的LiOAc/TE溶液(按Clontech公司酵母培养手册方法配制), 轻轻混匀, 于30℃温箱孵育30 min, 42℃水浴热激15 min, 离心收集酵母菌体, 涂布在营养缺陷型培养基SD/-Ura/-Trp平板上, 于30℃培养。酵母文库按照Clontech公司BD Matchmaker Library Construction & Screening Kits操作手册提供的方法制备。

依据前期报道的方法^{[ 24]}克隆烟草 PMT1a基因启动子的GAG片段, 然后用生物素标记的正向引物5'-Biotin-ACTAGTCTAACCCTGCACG-3'和反向引物5'-TCTAGAAGTGGAGGGCGC-3'进行PCR扩增, 获得生物素标记的DNA探针, 通过电泳分离和切胶回收纯化DNA探针, 将探针终浓度稀释至250~300 ng µL^-1。

将分别导入pYD1-Rec (阴性对照)和pYD1-MYC2a (阳性对照)载体的EBY100细胞在葡萄糖为碳源的SD/-Ura/-Trp培养基平板上画线培养后, 接种至相同碳源的SD/-Ura/-Trp液体培养基, 30℃过夜振荡培养。然后, 离心收集培养的酵母细胞, 重悬于半乳糖为碳源的SD/-Ura/-Trp液体培养基, 并稀释至OD₆₀₀=0.5, 于20℃继续振荡培养24 h诱导表面展示蛋白表达。同时, 用葡萄糖为碳源的SD/-Ura液体培养基培养EBY100细胞用于封闭试验体系的非特异结合。

配制新鲜DNA结合酵母分离缓冲液1×buffer [25 mmol L^-1 HEPES-KOH, pH 7.4, 30 mmol L^-1 KCl, 5 mmol L^-1 MgCl₂, 1 mmol L^-1 EDTA, 0.2 mg mL^-1 poly(dI-dC)和0.1% BSA]。离心收集完成了表面展示蛋白诱导表达的酵母细胞, 并依据其OD₆₀₀吸收值, 用1×buffer稀释至每毫升含1×10⁷个细胞备用。同时, 离心收集用作封闭菌液的EBY100细胞, 以1×buffer稀释至每毫升含1×10⁷菌液备用。

DNA结合酵母筛选方案如 图1所示。

图1

Fig. 1

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图1 酵母表面展示技术分离DNA结合蛋白实验方案示意图Fig. 1 Schematic diagram of DNA-binding protein isolation using yeast surface display

方案一: (1)将带链亲和素的磁珠10 µL (约100 µg磁珠)加入1 mL 1×buffer, 混匀, 置磁力架上, 待磁珠被吸附后去上清液, 如此重复3次平衡磁珠; (2)分别将上述制备的阴性对照和阳性对照菌液1 µL, 加入1 mL封闭菌液(即以1∶1000的比例将对照菌液用EBY100封闭细胞稀释), 混匀后加入生物素标记的DNA探针(1.5 µg, 约20 pmol), 于25℃自旋式混匀仪上, 以20转 min^-1孵育30 min, 使生物素标记的DNA探针与酵母细胞结合; (3)加入20 µL平衡处理的链亲和素磁珠, 继续在25℃自旋式混匀仪上, 以20转 min^-1孵育30 min, 完成磁珠与DNA探针复合物的结合; (4)在磁力架的帮助下, 移除未结合菌液, 并用1×buffer洗涤3次, 将结合了酵母细胞的磁珠悬于100 µL 1×TE溶液, 分别涂布于YPD及SD/-Ura/-Trp培养基平板, 于30℃恒温箱培养2 d, 观察统计菌落数。

方案二: (1)用方案一之(1)的方法平衡磁珠; (2)将平衡过的磁珠和1.5 µg (约20 pmol)生物素标记的DNA探针加入1 mL 1×buffer (DNA探针的终浓度为20 pmol 100 µg^-1磁珠), 混匀后于25℃自旋式混匀仪上以20转 min^-1孵育30 min, 然后在磁力架的帮助下除去未结合的DNA探针, 用1×buffer洗涤3次后重悬于100 µL 1×buffer备用; (3)在1 mL封闭菌液中, 加入20 µL结合了DNA探针的磁珠, 于25℃自旋式混匀仪上以20转 min^-1孵育30 min, 在磁力架的帮助下移除封闭菌液, 用1×buffer洗涤3次备用; (4)在封闭过的磁珠探针复合体中分别加入上述制备的阴性对照和阳性对照菌液1 µL, 加入1 mL封闭菌液, 混匀后于25℃自旋式混匀仪上以20转 min^-1孵育30 min, 然后, 在磁力架的帮助下移除未结合的菌液, 用1×buffer洗涤3次, 将结合了酵母细胞的磁珠悬于100 µL 1×TE溶液, 分别涂布于YPD和SD/-Ura/-Trp培养基平板, 于30℃恒温箱培养2 d, 观察统计菌落数。

以TRIzol试剂提取茉莉素处理6 h的烟草根总RNA, 将总RNA在无RNase活性的DNaseI作用下, 去除DNA污染, 进行纯化, 获得构建cDNA文库所需RNA。然后, 按照Clontech公司BD Matchmaker Library Construction & Screening Kits的操作手册进行烟草根RNA的cDNA合成、扩增和纯化。

用 Sma I限制性内切酶对pYD1-Rec载体酶切后, 电泳切胶回收载体DNA, 使载体DNA浓度达到1 µg µL^-1; 将纯化后的双链cDNA与pYD1-Rec载体, 按照Clontech公司BD Matchmaker Library Construction & Screening Kits操作手册提供的酵母转化方案共转化酵母EBY100, 涂布于SD/-Ura/-Trp培养基平板上, 于30℃培养24~48 h, 待酵母菌落生长至直径约0.5~1.0 mm时, 将酵母菌落通过刮板的方式悬浮于葡萄糖为碳源的SD/-Ura/-Trp液体培养基, 并于30℃振荡培养5 h, 获得烟草cDNA的酵母表面展示文库。然后, 离心收集酵母文库, 并重悬于半乳糖为碳源的SD/-Ura/-Trp液体培养基, 诱导表达酵母表面展示蛋白。

根据1.6中的筛选方案二, 以生物素标记的GAG片段作DNA探针, 对完成表面展示蛋白诱导表达的1×10⁷酵母表面展示文库细胞进行筛选, 将筛选到的酵母单菌落分别培养后, 提取酵母质粒转化大肠杆菌DH5α, 然后从阳性菌株分离质粒并测序。

按照前期报道的方法^{[ 24]}进行阳性对照MYC2a的DNA结合域蛋白表达载体构建、蛋白表达及纯化, 其PCR扩增引物为5°-AAAACCATGGAGAATAAG AAGAAGAAAAGGTCAC-3°和5°-AAAACTCGAG GCGTGTTTCAGCAACTCT-3°。筛选出的2个ERF转录因子ERF71和ERF72, 分别用特异引物扩增(ERF71: 5°-AAACCATGGAAGATCATCAACAAAG-3°和5°-AAACTCGAGAAAATCCCAAATAGATTCATG ATG-3°; ERF72: 5°-ATGGACTCCAACGAAGATC-3°和5°-AAACTCGAGAAAATACTCAAATTCAATAAC CTTCTCTTC-3°; 下画线标记序列为引入的酶切位点), 并通过 Nco I和 Xho I酶切位点构建至pET28b原核蛋白表达载体(Novagen公司); 克隆ERF72时, pET28b载体的 Nco I切点酶切后需要补平。构建完成的原核表达载体被导入大肠杆菌菌株BL21(DE3), 在含1 mmol L^-1 IPTG的LB培养基中于37℃培养3 h诱导蛋白表达。按Invitrogen公司Ni⁺亲和柱的说明书纯化带组氨酸标签的重组蛋白。

在Gel-shift (凝胶迁移率滞阻试验)试验中, 将4 μg纯化蛋白与5 ng生物素标记的GAG片段DNA探针在30 μL结合缓冲液[25 mmol L^-1 Hepes-KOH, pH 7.4, 50 mmol L^-1 KCl, 0.1 mmol L^-1 EDTA, 5%甘油, 0.5 mmol L^-1 DTT和200 ng poly(dI-dC)]中混匀, 于室温孵育15 min, 用0.5×TBE缓冲液配制的4% (w/v)聚丙烯酰胺凝胶分离, 然后通过半干电转移方法将分离的反应物转移至尼龙膜上, 并用紫外交联后, 以Roche公司的生物素检测试剂盒检测试验结果。

通过酵母单杂交试验检验筛选出的DNA结合蛋白与GAG片段在酵母中的相互作用, 所用试验系统为Clontech公司的MATCHMAKER酵母单杂交系统, 所用激活域表达载体为pGADT7-Rec2。GAG片段的4次重复序列被分别克隆至pHISi-1和pLacZi载体的报告基因启动子中, 随后这2个载体被共同导入酵母菌株YM4271, 获得酵母单杂交所需的报告菌株。MYC2a、ERF71和ERF72的DNA结合域片段用1.9的克隆方法导入酵母单杂交激活域表达载体pGADT7-Rec2, 然后分别转化酵母报告菌株, 在营养缺陷型培养基SD/-Leu/-Ura/-His上于30℃培养, 在用于检测蛋白与DNA互作的培养基中加入15 mmol L^-1 3-AT (3-氨基-1, 2, 4-三唑)。酵母培养所需营养缺陷型培养基的配制及蛋白与GAG片段在酵母中的相互作用分析按照Clontech公司Match-Maker酵母单杂交系统提供的方法操作。

通过 EcoR I和 Xho I双酶切将酵母单杂交系统载体pGADT7-Rec2中的Smart重组片段转移至酵母表面展示载体pYD1, 获得了重组载体pYD1-Rec, 其结构如 图2所示。pYD1-Rec载体具有Clontech公司Smart文库构建系统必须的Smart III和CDS III引物序列, 并有线性化pYD1-Rec载体的 Sma I酶切位点, 可与Smart文库构建试剂盒匹配用于酵母表面展示文库构建, 简化了酵母表面展示文库的构建过程。

图2

Fig. 2

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图2 pYD1-Rec 载体结构Fig. 2 Structure of pYD1-Rec vector

采用2种试验方案进行了比较研究。如1.6所述, 方案一先让DNA探针和酵母细胞结合, 然后用链亲和素磁珠分离结合了DNA探针的酵母细胞; 方案二则用预先结合了DNA探针的磁珠分离可结合DNA探针的酵母细胞。 表1所示为按照1.6所述试验方案通过3次重复试验得到的筛选效率对比结果。 图3所示, 为筛选结果的酵母生长情况。从对阳性对照的筛选结果中可以看出, 用方案二的方法筛选DNA探针结合酵母的效率较高, 更有利于分离含有DNA探针结合蛋白的酵母细胞。同时, 对阴性对照的筛选结果显示2种实验方案都会有极少数非特异结合酵母得到分离。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 DNA结合蛋白筛选对照试验结果 Table 1 Result of DNA-binding protein isolation 方案一 Strategy I 方案二 Strategy II 阴性对照 Negative control 阳性对照 Positive control 阴性对照 Negative control 阳性对照 Positive control YPD 70±13 113±24 89±14 184±42 SD/-Ura/-Trp 5±4 32±11 7±3 116±17

表1 DNA结合蛋白筛选对照试验结果 Table 1 Result of DNA-binding protein isolation

图3

Fig. 3

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图3 酵母生长情况Fig. 3 Growth of yeast cells

上述结果说明本研究设计的试验方案在利用酵母表面展示系统筛选DNA结合蛋白的研究中具有可行性。由于应用方案二筛选DNA探针结合酵母细胞的效率较高, 因此, 在利用酵母表面展示系统筛选烟草 PMT基因启动子GAG片段结合蛋白的研究中采用了方案二的试验体系。

利用启动子元件分析比较详细的烟草尼古丁合成基因 PMT启动子的茉莉素应答核心元件GAG片段作为DNA探针, 对烟草cDNA酵母表面展示文库进行了筛选。由于烟草尼古丁在根部合成, 且 PMT基因受茉莉素诱导表达^{[ 15, 16, 18, 19, 20, 22, 27]}, 因此, cDNA酵母表面展示文库的构建选用从茉莉素处理的烟草根中提取的总RNA以增加 PMT基因调控因子在酵母表面展示文库中的比例。按照方案二的试验体系对烟草根cDNA酵母表面展示文库进行了2次筛选, 每次筛选约1×10⁷酵母细胞。为更好地去除非特异结合细胞, 在筛选中用1×buffer洗涤了4次。通过2次筛选共获得约180个阳性克隆, 对阳性克隆载体中插入的cDNA片段长度分析后对其中80个克隆进行了测序分析, 其中有bHLH转录因子基因1个, ERF转录因子基因2个, 这2类转录因子可能与GAG片段中的G-box和GCC-box-like元件互作; 在其余克隆中还有1个MYB转录因子基因及一些非转录因子基因。

为验证筛选出的DNA结合蛋白与所用DNA探针的特异结合, 通过蛋白与DNA的体外结合试验检测了筛选的ERF转录因子与GAG片段的相互作用。将筛选到的ERF转录因子的DNA结合域分别克隆到pET28b载体中与载体的6×His标签融合, 并导入大肠杆菌BL21中, 进行原核蛋白诱导表达。同时, 将前期报道的GAG片段结合蛋白MYC2a^{[ 24]}的DNA结合域按照文献所述方法进行原核蛋白诱导表达, 作为检测转录因子蛋白与GAG片段互作的阳性对照。经过IPTG诱导原核蛋白表达后, 利用Ni²⁺离子琼脂糖树脂对含有上述蛋白表达载体的大肠杆菌BL21细胞裂解物进行纯化, 获得相应纯化蛋白。 图4所示为克隆到的2个ERF转录因子的序列结构。 图5所示为纯化的ERF转录因子及MYC2a转录因子蛋白。

图4

Fig. 4

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图4 ERF转录因子的序列结构 灰色背景部分为ERF结构域。Sequences in gray block are the ERF domains.Fig. 4 Sequences of ERF transcription factors

图5

Fig. 5

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图5 ERF转录因子的蛋白表达纯化Marker为蛋白分子量标准。 Marker indicates protein molecular weight marker.Fig. 5 Purified proteins for ERF transcription factors

Gel-shift (凝胶迁移率滞阻实验)是体外检测蛋白与DNA互作的主要方法。在获得筛选到的ERF转录因子及阳性对照MYC2a转录因子DNA结合域的原核表达蛋白后, 利用生物素标记的GAG片段作为DNA探针, 通过Gel-shift试验检测这些蛋白与GAG片段的相互作用。如 图6所示, 无蛋白的泳道没有滞阻条带, 有MYC2a转录因子DNA结合域蛋白的阳性对照泳道及有ERF转录因子DNA结合域蛋白的泳道都有滞阻条带。这些结果说明筛选到的ERF转录因子可以与GAG片段互作, 也表明本研究建立的酵母表面展示系统试验体系可以成功应用于DNA结合蛋白的筛选。

图6

Fig. 6

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图6 ERF转录因子与GAG片段的体外互作分析Control: 未加蛋白阴性对照; MYC2a: 阳性对照。Fig. 6 Interaction in vitro between ERF transcription factors and GAG fragmentControl: negative control without protein; MYC2a: positive control.

将MYC2a、ERF71和ERF72分别导入GAG片段的酵母单杂交报告菌株, 检测其与GAG片段的相互作用。 图7所示, 分别导入MYC2a、ERF71和ERF72的酵母均无法在含15 mmol L^-1 3-AT的SD/- Leu/-Ura/-His/3-AT营养缺陷型培养基上生长( 图7-B), 而且在无3-AT的SD/-Leu/-Ura/-His营养缺陷型培养基上生长的菌落也无法激活β-半乳糖苷酶报告基因的表达( 图7-C)。表明ERF71和ERF72同MYC2a一样虽然可在体外试验中与GAG片段结合, 但都不能在酵母单杂交试验中与GAG片段互作。

图7

Fig. 7

Figure Option ViewDownloadNew Window

图7 ERF转录因子与GAG片段在酵母中的互作分析A: 酵母在SD/-Leu/-Ura/-His培养基上的生长; B: 酵母在SD/-Leu/-Ura/-His/3-AT培养基上的生长; C: β-半乳糖苷酶活性分析; D: 平板上的酵母菌株分布图; MYC2a为GAG结合蛋白对照。Fig. 7 Interaction in vivo between ERF transcription factors and GAG fragmentA: growth of yeast on SD/-Leu/-Ura/-His plate; B: growth of yeast on SD/-Leu/-Ura/-His/3-AT plate; C: β-galactopyranoside activity assay; D: labeling of yeast strains; MYC2a is used as a control that binds GAG fragment.