选用128份国内不同水旱生态型小麦品种(系)进行该约66.2 kD的目标蛋白与小麦抗旱性关系的分析。为定位该目标蛋白基因, 选取杂交组合晋麦47×西农2208的230个F₃株系构建分离群体进行遗传分析。晋麦47属抗旱性强品种, 水分胁迫后表达目标蛋白; 西农2208属抗旱性极弱品种, 水分胁迫后不表达目标蛋白。

2010—2011年度在陕西杨凌和岐山两点鉴定128份小麦品种(系)全生育期的抗旱性。田间试验采用裂区设计, 水分差异为主处理, 设置为人工灌溉和雨养, 每处理3次重复; 品种为副处理, 每品种2行, 行长2.0 m, 行距0.25 m, 株距0.033 m。雨养区靠自然降水, 两地小麦生长期降雨量分别为186.8 mm^{[ 12]}和191.1 mm (岐山县气象局), 水灌区除自然降水外冬季灌溉1次, 灌溉量为780 m³ hm^-2。其他栽培措施与当地大田生产所用的一致。成熟后每品种(系)收获0.046 m², 脱粒、晾晒后称重, 计算单位面积产量。参照兰巨生^{[ 13]}的方法计算抗旱指数。

1.3.1 幼苗的培养与处理 随机取每个品种(系)和F₃株系的种子各24粒, 自来水催芽至露白, 腹沟向下均匀摆放在铺有单层滤纸的苗床上。22℃避光条件下水培7 d, 然后移至室内光照充足处, 温度21℃±3℃下继续培养, 待小麦幼苗长至两叶时, 倒掉苗床中水分, 加入-0.5 MPa PEG-6000溶液15 mL, 第2天再加入10 mL, 进行48 h胁迫处理。参照Michel等^{[ 14]}介绍的方法配制PEG-6000溶液。

1.3.2 叶片蛋白的提取与SDS-PAGE电泳 经水分胁迫处理后, 剪取每个幼苗等量叶片, 按照改进的TCA-丙酮法^{[ 10]}提取叶片蛋白, 然后参照范锋贵等^{[ 2]}描述的方法进行SDS-PAGE电泳和目标蛋白表达检测。

1.3.3 图像采集及分析 经染色、显影后采集凝胶图像。将128个品种(系)分为目标蛋白表达和不表达2类; 将230个F₃株系分为所有单株均表达目标蛋白(I)、单株表达分离(II)和所有单株均不表达(III) 3类, 同时根据F₃株系的目标蛋白表达类型推断其对应F₂单株的基因型, 分析目标蛋白基因在后代的遗传分离特点。

为明确目标蛋白表达与小麦抗旱性的关系, 分析目标蛋白表达与不表达品种(系)的抗旱性, 应用SPSS17.0软件对其抗旱指数进行差异显著性检验。

用CTAB法^{[ 15]}提取亲本和F₃株系的基因组DNA。分别选择10个I类和10个III类株系的DNA等量混合, 构成目标蛋白表达(Br)和不表达(Bs)基因池。随机选取分布于小麦21条染色体上的126对SSR引物^{[ 16, 17, 18]} (http://wheat.pw.usda.gov/), 以晋麦47、西农2208、Br、Bs和F₃作图群体的DNA为模板进行PCR扩增。所有引物均由上海英骏技术公司合成。PCR反应体系为10 μL, 包括10 × buffer 1.0 μL、50 ng μL^-1 DNA 1.0 μL、2.5 mmol L^-1 dNTPs 0.6 μL、10 μmol L^-1上下游引物各0.25 μL、5 U μL^-1 Taq酶0.1 μL和6.8 μL ddH₂O。用MJ Research PTC-200型PCR仪进行扩增反应, 扩增程序为94℃预变性 5 min; 95℃变性40 s, 50~65℃退火40 s, 72℃延伸 1 min, 共35个循环; 最后72℃延伸10 min。扩增产物经6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳, 硝酸银染色显影后观察并记录。

根据扩增产物的多态性, 筛选与目标蛋白表达亲本一致的SSR标记, 与晋麦47带型一致的记作“2”, 与西农2208带型一致的记作“0”, 杂合带型记作“1”, 结合F₃代株系蛋白表达类型, 用QTL IciMapping软件进行多态性分析, 得到各标记的遗传连锁数据, 并绘制目标蛋白基因 RpDD的遗传连锁图谱。

用CTAB法^{[ 15]}提取128份小麦品种(系)的基因组DNA, 用与 RpDD两侧紧密连锁的分子标记检测, 分析紧密连锁标记的有效性及其与小麦抗旱性的关系, 扩增程序与带型统计方法同前。

一年两点全生育期的抗旱性鉴定结果显示, 128份小麦品种(系)之间的抗旱指数变异明显, 可分为极强、强、中等、弱和极弱5个抗旱性等级, 每个等级所包含的品种数不同(表1)。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 128份小麦品种(系)全生育期抗旱性鉴定结果 Table 1 The drought resistance of 128 wheat cultivars (lines) in whole growth period 抗旱性 Drought resistance 品种数 No. of varieties 比例 Proportion (%) 抗旱指数 Drought resistance index 目标蛋白a Target proteina 平均 Average 变幅 Range 表达 Positive 不表达 Negative 极强 Highly resistant 5 3.9 1.34 1.30-1.43 5 (100.0%) 0 强 Resistant 13 10.2 1.16 1.10-1.25 11 (84.6%) 2 (15.4%) 中等 Moderate resistant 59 46.1 0.98 0.89-1.08 41 (69.4%) 18 (30.6%) 弱 Sensitive 31 24.2 0.81 0.72-0.89 8 (25.8%) 23 (74.2%) 极弱 Highly sensitive 20 15.6 0.57 0.39-0.69 2 (10.0%) 18 (90.0%) 合计 Total 128 100.0 0.90 0.39-1.43 67 61 a括号外为品种数, 括号内为占该抗性等级所有品种的百分比。 aVariety number and its proportion in the resistance grade are listed outside and inside parenthesis, respectively.

表1 128份小麦品种(系)全生育期抗旱性鉴定结果 Table 1 The drought resistance of 128 wheat cultivars (lines) in whole growth period

经-0.5 MPa PEG-6000胁迫处理48 h后, 应用SDS-PAGE方法检测目标蛋白, 128个品种(系)中67个检测到目标蛋白, 61个未检测到目标蛋白。随着抗旱性等级的降低, 水分胁迫后表达目标蛋白的品种(系)数所占的比例减少(表1), 表明目标蛋白是否表达与品种(系)抗旱性等级有密切关系。

表达目标蛋白的67个品种(系)的平均抗旱指数为1.00, 不表达目标蛋白的61个品种(系)的平均抗旱指数平均值为0.80, 两者有极显著差异( P<0.01)。说明该约66.2 kD水分胁迫应答蛋白的表达与品种(系)的抗旱性密切相关, 可作为检验品种(系)抗旱性的一项指标。

-0.5 MPa PEG-6000处理后, 根据各株系中单株检测结果, 将230个F₃株系分为I类(全表达) 56个、II类(分离) 113个、III类(全不表达) 61个(表2和图1)。根据F₃株系目标蛋白的表达类型判断其对应的F₂单株基因型, 即F₂单株有56份由纯合表达基因型组成, 113份由杂合基因型组成, 61份由纯合不表达基因型组成, 其分离符合1∶2∶1遗传比例(χ²=0.29, χ²_0.05= 5.99), 表明在杂交组合晋麦47×西农2208后代群体中目标蛋白由1对显性基因控制。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 F2群体中 RpDD等位基因及其微卫星标记位点的分离 Table 2 Segregations of gene RpDDand its microsatellite markers in F2 population 位点 Locus 株系数 No. of lines χ2(1:2:1) I II III RpDD 56 113 61 0.29 Xbarc56 60 107 63 1.19 Xbarc117 64 107 59 1.19 Xbarc197 68 109 53 2.58 Xgwm129 66 113 51 2.03 Xgwm304 52 112 66 1.86 I: 纯合表达; II: 分离; III: 纯合不表达。χ20.05=5.99。 I: Homozygous expression; II: Heterozygous expression; III: Homozygous non-expression. χ20.05=5.99.

表2 F2群体中 RpDD等位基因及其微卫星标记位点的分离 Table 2 Segregations of gene RpDDand its microsatellite markers in F2 population

图1

Fig. 1

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	图1 F3株系中3种类型目标蛋白表达图谱箭头指示目标蛋白位置。I: 纯合表达; II: 分离表达; III: 纯合不表达。Fig. 1 Patterns of three type target protein expressions in F3 linesArrow points to the target protein. I: homozygous expression; II: heterozygous expression; III: homozygous non-expression.

随机选取分布于小麦21条染色体上的126对SSR引物, 对晋麦47、西农2208、表达池(Br)和不表

达池(Bs)进行多态性筛选, 结果5A染色体上的引物 Xgwm129和 Xgwm304在双亲及两池间扩增出一致的多态性片段, 这也验证了王婧等^{[ 11]}的研究结果。随后选取小麦5A染色体上的57对SSR引物在亲本和两池间进行多态性筛选, 结果除以上2对引物外, Xbarc56、 Xbarc117和 Xbarc197也在亲本和两池间表现出一致的多态性, 上述5对SSR引物都位于小麦染色体5A短臂上。随后利用这5对引物对杂交组合晋麦47×西农2208的230份F₃株系基因组DNA进行扩增, 结果蛋白表达为I类型的株系多数扩增出与晋麦47相同的带型, 蛋白表达为III类型的株系多数扩增出与西农2208一致的带型, 蛋白表达为II类型的大部分扩增出双亲的组合带型, 由此表明这5个SSR标记位点与目标基因连锁(表2)。图2为引物 Xbarc56和 Xbarc117对部分F₃株系的PCR扩增图谱。统计各位点的带型, 用QTL IciMapping软件进行连锁分析, 绘制了目标基因 RpDD的遗传连锁图(图3)。

图2

Fig. 2

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图2 SSR 引物 Xbarc56 和 Xbarc117 对部分F3 株系的PCR扩增图谱M: DNA marker; P1: 晋麦47; P2: 西农2208; Br: 目标蛋白表达池; Bs: 目标蛋白不表达池; 2: 目标蛋白表达株系;1: 杂合株系; 0: 目标蛋白不表达株系。Fig. 2 PCR profiles of Xbarc56 and Xbarc117 in partial F3linesM: DNA marker; P1: Jinmai 47; P2: Xinong 2208; Br: with target protein pool; Bs: without target protein pool; 2: with target protein lines; 1: heterozygous lines; 0: without target protein lines.

图3

Fig. 3

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	图3 编码蛋白基因 RpDD在5AS上的微卫星遗传连锁图谱Fig. 3 Linkage map of gene RpDD on chromosome 5AS in wheat based on microsatellite markers

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利用目标蛋白基因 RpDD两侧紧密连锁的SSR标记 Xbarc56和 Xbarc117, 对来自全国不同水旱生态型的128份小麦品种(系)进行检测。结果表明, 73份品种(系)在 Xbarc56位点扩增出与晋麦47相同的带型, 其中58份水分胁迫后表达目标蛋白; 70份品种(系)在 Xbarc117位点扩增出与晋麦47相同带型, 其中59份水分胁迫后表达目标蛋白。67份品种(系)在 Xbarc56和 Xbarc117两位点均能扩增出与晋麦47一致的带型, 其中有58份品种(系)在水分胁迫条件下表达目标蛋白, 占86.6%; 这67份品种(系)包括5份抗旱性极强、11份强、48份中等、2份弱和1份极弱的品种(系), 在对应抗旱性等级品种(系)中所占的比例分别为100.0%、84.6%、81.4%、6.5%和5.0%, 即随着抗旱性的降低, 在两标记位点扩均增出与晋麦47相同带型品种(系)的数量减少, 而且这67份品种(系)的抗旱指数平均值(1.02)极显著高于其余61份的抗旱指数平均值(0.78)( P<0.01)。以上分析说明两标记与品种(系)的抗旱性有极密切的关系, 可作为小麦品种(系)抗旱性鉴定和筛选的分子指标。