58份供试大麦种质中, 56份来自中国的22个省、自治区, 代表不同的生态类型, 包括46份地方品种、5份野生型大麦和5份育成品种。其余2份国外种质来自叙利亚和伊朗(表1)。全部材料由中国农业科学院作物科学所国家农作物种质资源保藏中心提供。

选取每份材料10粒种子, 种于温室, 种子出苗2周后, 剪取嫩叶, 用CTAB法^{[ 6]}提取基因组DNA, 1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量, 紫外分光光度计检测DNA浓度。

选取每份材料100粒种子, 置3个铺有湿润滤纸的培养皿中, 于培养箱中15℃暗培养5 d后, 随机取20粒种子, 去除根和芽。采用3,5-二硝基水杨酸法^{[ 7]}测定α-淀粉酶活性。

1.3.1 引物设计 根据NCBI (http://www.ncbi. nlm.nih.gov/nuccore/166994)公布的 Amy6-4基因组序列(GenBank登录号为K02637.1), 与大麦中其他编码α-淀粉酶的同源基因序列比对结果, 选择在非同源区段, 设计覆盖 Amy6-4基因5′ UTR区、编码区和内含子区以及3′ UTR区的4对引物, 用于全长扩增(表2)。引物由北京赛百盛基因技术有限公司合成。

1.3.2 基因扩增与测序 PCR反应总体积为25 μL, 包含基因组DNA 25 ng、dNTP终浓度各0.25 μmol L^-1、引物终浓度各10 μmol L^-1、HiFi Taq DNA Polymerase (北京全式金生物技术有限公司) 1 U和1×buffer 25 μL。扩增程序为: 94℃预变性5 min; 94℃变性30 s, 退火30 s (温度因引物而异), 72℃延伸 1 min, 38个循环; 72℃终延伸10 min; 4℃保存。扩增产物经凝胶回收试剂盒(TIANGEN)纯化后, 送生工生物工程(上海)有限公司进行双向测序。利用BLAST工具(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/), 将测序结果与GenBank中的序列比对, 以确认扩增结果的正确性。

1.3.3 数据分析 利用Vector NTI Advance 10.0 (Invitrogen, USA)中的Contig-Express组件, 将相互覆盖的序列片段拼接, 用Clustal W1.83软件^{[ 8]}进行多序列比对, 将完成比对的序列保存为PHYLIP格式文件, 采用DnaSP 4.0软件(http://www.ub.es/dnasp)^{[ 9]}进行序列多样性分析及单倍型分析。分别利用 θ值^{[ 10]}和 π值^{[ 11]}估计核苷酸多样性。作为衡量核苷酸多样性的参数, θ值为衡量群体突变的参数, 与核苷酸变异占序列位点的比率有关。而 π值则反映同一位点不同序列间的差异。

根据Tajima^{[ 12]}提出的TajiIma’s D检验, 作中性检验, 以评价 Amy6-4基因是否经受了选择的影响。

1.3.4 系统发育树的构建 使用ClustalW1.83软件进行序列比对, MEGA4.0软件^{[ 13]}邻接法(neighbour- joining)构建系统发育树。

利用覆盖大麦基因组的41个SSR标记, 使用Structure2.0软件^{[ 14]}对58份样品进行群体结构分析。用DnaSP 4.0软件(http://www.ub.es/dnasp)计算 Amy6-4基因位点上任意2个多样性等位位点之间的 r²值, 绘制LD衰减图, 分析 Amy6-4位点等位基因之间的连锁不平衡。

将群体结构分析中各个品种的Q值作为协变量, 使用TASSEL 2.1软件(http://www.maizege netics.net/)的一般线性模型(general linear model, GLM)程序, 对测得的α-淀粉酶活性数据与 Amy6-4序列分析的SNP和单倍型数据进行回归分析。

以覆盖 Amy6-4全基因2902 bp的4对引物, 包括起始密码子前1168 bp的5′ UTR区、编码区以及264 bp 3′ UTR区, 对58份大麦种质进行分段扩增和序列比对(图1)。结果只有位于编码区的第3外显子和3′ UTR区存在单核苷酸多态性位点(SNP), 其中在编码区有4个SNP位点, 3′ UTR上存在3个SNP位点(图2), 构成5种单倍型(表3)。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 58份供试大麦种质的编号、原产地及特性 Table 1 Accession number, origin, and characteristics of 58 barley entries 品种编号Accession No. 原产地Origin 棱型Row number 皮裸性1)Covered/ naked1) 冬春性2)Growth habit2) 种质类型3)Germplasm type3) 单倍型类型Type of haplotype α-淀粉酶活性Activity of α-amylase ZDM2719 中国浙江 Zhejiang, China 2 C S C 2 0.753 ZDM8300 中国浙江 Zhejiang, China 2 C S C 2 0.869 ZDM3344 中国浙江 Zhejiang, China 6 C F L 3 1.063 ZDM2680 中国浙江 Zhejiang, China 2 C S L 1 1.127 ZDM2683 中国浙江 Zhejiang, China 2 C F L 1 1.127 ZDM2844 中国浙江 Zhejiang, China 6 C F L 1 1.245 ZDM4018 中国云南 Yunnan, China 6 C F L 3 0.777 ZDM1802 中国新疆 Xinjiang, China 6 N S L 3 1.265 ZDM1775 中国新疆 Xinjiang, China 2 C S L 1 1.252 ZDM4922 中国西藏 Tibet, China 6 N S C 3 1.429 ZP401 中国西藏 Tibet, China 6 C S W 3 0.991 ZP436 中国西藏 Tibet, China 6 N S W 3 0.703 ZDM4453 中国西藏 Tibet, China 6 N S L 3 0.863 ZP470 中国西藏 Tibet, China 6 N S W 3 0.703 ZP500 中国西藏 Tibet, China 6 C S W 3 1.231 ZP371 中国西藏 Tibet, China 6 N S W 3 0.989 ZDM4707 中国西藏 Tibet, China 6 N S L 3 1.185 ZDM3882 中国四川 Sichuan, China 6 N W L 3 1.075 ZDM5371 中国四川 Sichuan, China 6 C W L 3 1.473 ZDM93 中国陕西 Shaanxi, China 6 C S L 3 1.110 ZDM887 中国陕西 Shaanxi, China 6 C S L 1 0.661 ZDM119 中国山西 Shanxi, China 2 C S L 5 1.252 ZDM286 中国山东 Shandong, China 6 C W L 1 0.692 ZDM368 中国山东 Shandong, China 6 C W L 4 1.261 ZDM8102 中国青海 Qinghai, China 6 N S L 3 0.950 ZDM8154 中国青海 Qinghai, China 6 N S L 3 0.896 ZDM5210 中国内蒙古 Inner Mongolia, China 6 N S L 3 0.956 ZDM5212 中国内蒙古 Inner Mongolia, China 6 N S L 3 0.766 ZDM1406 中国内蒙古 Inner Mongolia, China 2 C S L 1 0.671 ZDM5203 中国内蒙古 Inner Mongolia, China 2 C S L 1 0.839 ZDM5206 中国内蒙古 Inner Mongolia, China 6 C S L 1 0.784 ZDM5263 中国江西 Jiangxi, China 6 C W L 1 0.776 ZDM5271 中国江西 Jiangxi, China 6 C W L 1 0.497 ZDM1838 中国江苏 Jiangsu, China 2 C S C 3 1.189 ZDM2398 中国江苏 Jiangsu, China 6 C W L 3 1.053 ZDM2038 中国江苏 Jiangsu, China 6 C F L 3 0.775 ZDM3516 中国湖南 Hunan, China 2 C S L 1 1.162 ZDM9621 中国湖北 Hubei, China 2 C F C 2 0.796

表1 58份供试大麦种质的编号、原产地及特性 Table 1 Accession number, origin, and characteristics of 58 barley entries

(续表1)

Table 1 Continued

(续表1)(Table 1 Continued)

(续表1) 58份供试大麦种质的编号、原产地及特性 Table 1 Continued Accession number, origin, and characteristics of 58 barley entries 品种编号Accession No. 原产地Origin 棱型Row number 皮裸性1)Covered/ naked1) 冬春性2)Growth habit2) 种质类型3)Germplasm type3) 单倍型类型 Type of haplotype α-淀粉酶活性Activity of α-amylase ZDM3447 中国湖北 Hubei, China 6 C W L 1 0.917 ZDM5240 中国黑龙江 Heilongjiang, China 6 C S L 3 0.824 ZDM1175 中国黑龙江 Heilongjiang, China 6 C S L 1 1.255 ZDM860 中国河南 Henan, China 6 N S L 3 1.079 ZDM586 中国河南 Henan, China 6 C S L 1 1.209 ZDM14 中国河北 Hebei, China 6 C S L 1 1.265 ZDM8986 中国贵州 Guizhou, China 6 C F L 3 1.053 ZDM8981 中国贵州 Guizhou, China 6 C W L 1 0.781 ZDM3883 中国贵州 Guizhou, China 2 C S L 1 1.371 ZDM3901 中国贵州 Guizhou, China 6 C W L 1 1.330 ZDM3629 中国广东 Guangdong, China 6 C W L 1 1.245 ZDM8055 中国甘肃 Gansu, China 6 N S L 3 0.868 ZDM7825 中国甘肃 Gansu, China 2 C S L 3 1.516 ZDM8018 中国甘肃 Ganshu, China 6 N S L 3 1.115 ZDM3606 中国福建 Fujian, China 6 N S L 3 1.145 ZDM5258 中国安徽 Anhui, China 6 C F L 1 0.505 ZDM5260 中国安徽 Anhui, China 6 C F L 1 0.655 ZDM5261 中国安徽 Anhui, China 6 C F L 1 0.754 WDM4911 伊朗 Iran 6 N S L 3 0.587 WDM3692 叙利亚 Syria 6 C S L 3 0.784 1) C和N分别代表皮大麦和裸大麦;2) S、W和F分别代表春性、冬性和半冬性;3) C、L和W分别代表栽培品种、地方品种和野生种。 1) C and N stand for covered and naked barely, respectively;2) S, W, and F stand for spring, winter, and facultative barely, respectively;3) C, L, and W stand for cultivar, landrace, and wild species, respectively.

(续表1) 58份供试大麦种质的编号、原产地及特性 Table 1 Continued Accession number, origin, and characteristics of 58 barley entries

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 用于扩增 Amy6-4基因不同区段的引物 Table 2 Primers for Amplification of different parts of Amy6-4 gene in barley 引物 Primer 序列 Sequence (5′-3′) 产物期望大小 Expected product (bp) 退火温度 Annealing temp. (℃) 正向 Forward 反向 Reverse Amy6-4_1 CGTTCAAAGCGTGTGTTATTTT CATGATCGCGGTACATACAGA 1306 61 Amy6-4_2 CCATCTACATCACTTGGGCATT ATGAACGAAACCAAGAAAAGAAA 1420 59 Amy6-4_3 TCTGTATGTACCGCGATCATGT TGTATCATATAGGAACTTGTAGAGCTG 1400 62 Amy6-4_2 TTTCTTTTCTTGGTTTCGTTCA AAGCTTTTGGTTATCTATATCCATTG 590 61

表2 用于扩增 Amy6-4基因不同区段的引物 Table 2 Primers for Amplification of different parts of Amy6-4 gene in barley

Amy6-4基因的第3外显子和3′ UTR存在多样性(图1和图2)。于第3外显子2442 bp处有一个C/G颠换多态性位点, 为一同义突变, 对应于氨基酸序列的第360位点精氨酸(R); 2477 bp位点为A/G转换SNP位点, 为非同义突变, 导致第372位点的氨基酸由天冬酰胺(N)突变为丝氨酸(S); 2587 bp有一个G/A转换SNP位点, 为同义突变, 对应于第405位点甘氨酸(G); 位于2591 bp出现一个G/C颠换SNP位点, 为非同义突变, 导致第410位点的氨基酸由甘氨酸(G)突变为丙氨酸(A)。该基因的3′ UTR区有3个SNP位点, 分别是位于2655 bp的G/A、2657 bp的G/C和2840 bp的G/A多态性位点。在供试的58份大麦材料中, H_3单倍型的出现频率最高, 达51.7% (30/58); 其次为H_1单倍型, 频率为39.7% (23/58); 其他3种单倍型的频率均较低(表3)。

以核苷酸多样性 π值和 θ为指标, 通过对58份大麦材料 Amy6-4基因第3外显子和3′ UTR区的序列多样性研究, 基本明确了相应于 Amy6-4基因全序列, 在长度为475 bp区段内单核苷酸多样性(SNP)分布规律。 π值从2442 bp的0.0075上升至2477 bp的0.001 25, 此后开始下降至0.005, 再从2587 bp到2591 bp迅速升高到最大值0.015 (即在编码区的SNP3), 再次下降; 在3′ UTR区下降到最低值, 接近0后再次升高, 表现为先升后降—再升再降—再升的变化趋势, 而其他区段则相对保守(图3)。

2个多样性参数( θ和 π)的估计值0.005 80和0.007 13, 差异不显著, 表明 θ值和 π值的变化趋势较为一致。

利用 Amy6-4序列中的多态性位点(SNP)的TajiIma’s D检验, 本试验中TajiIma’s D值为0.697 25, 在 P= 0.1水平未达到显著, 说明该基因在进化过程中, 未经受选择作用的影响, 其序列变异为选择中性。

图1

Fig. 1

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图1 Amy6-4第3外显子和3′ UTR的7个SNP的核苷酸序列(475 bp)比对Fig. 1 Nucleotide alignment with seven SNPs detected in the third exon and 3′ UTR for Amy6-4gene

图2

Fig. 2

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	图2 Amy6-4结构示意图及在第3外显子和3′ UTR上的多态性位点(SNP)Fig. 2 Schematic structure of Amy6-4 with all detected SNPs, located in the third exon and the 3′ UTR

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 在58份大麦种质中发现的 Amy6-4的单倍型 Table 3 Haplotypes in Amy6-4 gene among 58 barley entries 单倍型 Haplotype 种质数 No. of entries 频率 Frequency (%) 多态性位点 Polymorphic loci 2442C 2477C 2587C 2591C 2655U 2657U 2840U H_1 23 39.7 G A G C A C A H_2 3 5.2 C G A G G G G H_3 30 51.7 C G G G G G G H_4 1 1.7 C A G G A C G H_5 1 1.7 G G G G G C G 多态性位点表示为核苷酸序数+所在区域, 其中C表示编码区, U表示3′ UTR区。H_1单倍型包括种质ZDM14、ZDM286、ZDM887、ZDM1175、ZDM1406、ZDM1775、ZDM3447、ZDM3516、ZDM3629、ZDM5203、ZDM5206、ZDM5258、ZDM5260、ZDM5261、ZDM5263、ZDM5271、ZDM8981、ZDM2680、ZDM2683、ZDM586、ZDM2844、ZDM3883和ZDM3901; H_2单倍型包括种质ZDM2719、ZDM8300和ZDM9621; H_3单倍型包括种质ZDM860、ZDM3882、ZDM4922、ZDM8018、ZDM8102、ZP401、WDM3692、ZDM1838、ZDM5240、ZDM5371、ZDM1802、ZP436、ZDM4453、ZDM5210、ZDM8055、ZDM8986、ZP470、WDM4911、ZDM2398、ZDM3344、ZDM7825、ZDM4018、ZDM2038、ZP500、ZP371、ZDM8154、ZDM5212、ZDM4707、ZDM3606和ZDM93; H_4单倍型包括种质 ZDM368; H_5单倍型包括种质ZDM119。 The polymorphic locus is named as the series number of the nucleotide plus the letter “C” (coding region) or “U” (3′ UTR region). The H_1 haplotype included entries ZDM14, ZDM286, ZDM887, ZDM1175, ZDM1406, ZDM1775, ZDM3447, ZDM3516, ZDM3629, ZDM5203, ZDM5206, ZDM5258, ZDM5260, ZDM5261, ZDM5263, ZDM5271, ZDM8981, ZDM2680, ZDM2683, ZDM586, ZDM2844, ZDM3883, and ZDM3901; the H_2 haplotype included entries ZDM2719, ZDM8300, and ZDM9621; the H_3 haplotype included entries ZDM860, ZDM3882, ZDM4922, ZDM8018, ZDM8102, ZP401, WDM3692, ZDM1838, ZDM5240, ZDM5371, ZDM1802, ZP436, ZDM4453, ZDM5210, ZDM8055, ZDM8986, ZP470, WDM4911, ZDM2398, ZDM3344, ZDM7825, ZDM4018, ZDM2038, ZP500, ZP371, ZDM8154, ZDM5212, ZDM4707, ZDM3606, and ZDM93; and the H_4 and H_5 haplotypes included entries ZDM368 and ZDM119, respectively.

表3 在58份大麦种质中发现的 Amy6-4的单倍型 Table 3 Haplotypes in Amy6-4 gene among 58 barley entries

图3

Fig. 3

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图3 Amy6-4基因序列多样性Fig. 3 Sequence diversity of Amy6-4 gene

根据58份种质 Amy6-4基因第3外显子和3′ UTR区域SNP变异所构成的5种单倍型, 构建了系统发育树, 发现单倍型H_1与H_4、H_2与H_3、H_5与H_3亲缘关系最近; 其次是单倍型H_1、H_2、H_3和H_4均与H_5较近; H_1和H_4都与H_3较远, 与H_2最远; H_2、H_3和H_5均与H4较远, 与H_1最远(图4)。对各种单倍型品种的来源(表1和表3)分析可知, H_1单倍型的23份种质地域分布较广, 来自中国14个省、自治区; H_2单倍型的3个品种全部是育成品种, 来自中国的浙江和湖北; H_3单倍型的30个品种中, 除2份国外大麦种质外, 其余均为中国青藏高原及其相邻省区的参试品种, 包括西藏8个、四川2个、云南1个、甘肃3个; H_4和H_5单倍型各仅包括1个品种。为分析不同 Amy6-4单倍型大麦的特征特性, 了解5种单倍型在不同类型大麦中的分布, 根据表1数据和图4的聚类结果归纳出表4。可以看出, H_1单倍型包括的23份种质, 全部为皮大麦, 11个春性、12个冬性, 且此单倍型中来自南方的品种, 多为冬性或半冬性品种; H_2单倍型的3份种质也均是皮大麦, 且为育成品种; H_3单倍型的30份材料包括春性23份、冬性7份, 裸大麦17份、皮大麦13份; 单倍型H_4和H_5分别为山东六棱冬大麦(ZDM368)和山西的二棱春大麦品种(ZDM119)。

利用58份大麦材料 Amy6-4基因的重测序数据, 分析了该基因碱基序列中7个SNP位点间的连锁不平衡关系, 只有位于第2587 bp的SNP3(G/A)位点与其他6个SNP位点无连锁不平衡(LD)关系(图5)。其余6个SNP位点相互之间, 均存在显著的LD关系( R²=0.82~1.00)。

LD衰减程度对关联分析具有很大的影响。在对 Amy6-4基因第3外显子和3′ UTR区的SNP多态性位点LD分析的基础上, 进一步以 r²作为衡量指标检测该区域的LD衰减程度, 在 Amy6-4基因的多态性区域未检测到明显的LD衰减, r²值在0.8~1.0之间(图6)。表明在该基因的多态性区域内存在较高的锁不平衡度, 适宜进行基于候选基因的关联分析。

图4

Fig. 4

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图4 依据58份大麦种质 Amy6-4基因SNP多样性的系统发育树Fig. 4 Phylogennetic tree of 58 barley entries according to SNP diversity on Amy6-4locus

图5

Fig. 5

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图5 Amy6-4基因内的多态性位点(SNP)的连锁不平衡关系对角线上为 R2值, 对角线下为 P值; 矩形表示SNP间的相关性。Fig. 5 Linkage disequilibrium of the Amy6-4gene revealed in different sets of barley varieties by SNP-analysis R2 values and P-values are shown in the upper and lower diagonal, respectively. The rectangles show correlation between SNP combinations.

图6

Fig. 6

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图6 Amy6-4基因SNP位点间 r2值随遗传距离衰减散点图Fig. 6 Attenuation of r2values between SNP pairs along with genetic distance on Amy6-4 locus

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 Amy6-4基因的单倍型及其相应的不同特性样品数统计 Table 4 Haplotype patterns of Amy6-4gene and their affiliation to samples based on different barley traits 单倍型 Haplotype 多态性SNP Polymorphisic SNP (5′-3′) 大麦类型 Type of barley SNP1 SNP2a SNP3 SNP4a SNP5 SNP6 `SNP7 2r-s 6r-s 2r-W 6r-W N C H_1 G (Arg) A (Asn) G (Gly) C (Ala) A C A 7 4 1 11 — 23 H_2 C (Arg) G (Ser) A (Gly) G (Gly) G G G 2 — — 1 — 3 H_3 C (Arg) G (Ser) G (Gly) G (Gly) G G G 2 21 — 7 17 13 H_4 C (Arg) A (Asn) G (Gly) G (Gly) A C G — — — 1 — 1 H_5 G (Arg) G (Asn) G (Gly) G(Gly) G C G 1 — — — — 1 SNP位点后括号内字母表示编码的氨基酸;a表示该多态性位点编码的氨基酸发生替换。大麦类型中2r-S、6r-S、2r-W和6r-W分别代表二棱春大麦、六棱春大麦、二棱冬大麦和六棱冬大麦; N和C分别代表裸大麦和皮大麦。 Amino acids coded by the SNP are shown in the brackets follwing the SNP site; SNP marked witha indicates substititution of amino acid residue on this locus. Barley types 2r-S, 6r-S, 2r-W, and 6r-W represent two-rowed spring barley, six-rowed spring barley, two-rowed winter barley, and six-rowed winter barley, respectively; and types N and C represent naked and covered barley, respectively.

表4 Amy6-4基因的单倍型及其相应的不同特性样品数统计 Table 4 Haplotype patterns of Amy6-4gene and their affiliation to samples based on different barley traits

在 Amy6-4基因序列多态性LD及其衰减程度分析的基础上, 使用TASSEL软件的一般线性模型(GLM)程序, 将群体结构分析中 K=6时, 各参试样品Q值作为协变量, 分别对每个SNP和单倍型与实验测定的58份大麦种质的α-淀粉酶活性(表1)进行回归分析。结果显示, 各个SNP位点和各种单倍型, 均与α-淀粉酶活性间无关联性( P>0.05), 表明本研究检测的这些发生在α-淀粉酶编码基因上的等位变异均对酶活性没有影响。