选用本实验室保存的齐319、昌7-2、鲁原92、Mo17、478和178等6个育种上常用的玉米自交系为试验材料。

培养基成分及含量如表1所示。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 试验中用到的培养基及其成分 Table 1 Compositions of the media used in this study 培养基 Medium 成分 Composition 发芽培养基 Germination medium 0.5MS无机盐[ 15], 20 g L-1蔗糖, 8 g L-1琼脂, pH 5.8 0.5MS inorganic salts[ 15], 20 g L-1sucrose, 8 g L-1 agar, pH 5.8 诱导培养基 Callus induction medium N6无机盐[ 16], 2 mg L-1 2,4-D, 1.38 g L-1 L-脯氨酸, 0.1 g L-1水解酪蛋白, 30 g L-1蔗糖, 8 g L-1琼脂, pH 5.8 N6 inorganic salts[ 16], 2 mg L-1 2,4-D, 1.38 g L-1 L-proline, 0.1 g L-1 casein hydrolysate, 30 g L-1 sucrose, 8 g L-1 agar, pH 5.8 继代培养基 Subcuture medium N6无机盐, 2 mg L-1 2,4-D, 0.69 g L-1 L-脯氨酸, 0.1 g L-1水解酪蛋白, 20 g L-1蔗糖, 8 g L-1 琼脂, pH 5.8 N6 inorganic salts,, 2 mg L-1 2,4-D, 0.69 g L-1 L-proline, 0.1 g L-1 casein hydrolysate, 20 g L-1 sucrose, 8 g L-1 agar, pH 5.8 分化培养基 Regeneration medium MS无机盐, 1 mg L-1 6-BA, 0.5 g L-1 MES, 20 g L-1蔗糖, 8 g L-1琼脂, pH 5.8 MS inorganic salts, 1 mg L-1 6-BA , 0.5 g L-1 MES , 20 g L-1 sucrose, 8 g L-1 agar, pH 5.8 生根培养基 Rooting medium MS无机盐, 1 mg L-1 6-BA, 1 mg L-1 MET, 0.5 g L-1 MES, 20 g L-1蔗糖, 8 g L-1琼脂, pH 5.8 MS inorganic salts, 1 mg L-1 6-BA , 1 mg L-1 MET, 0.5 g L-1 MES, 20 g L-1 sucrose, 8 g L-1 agar, pH 5.8 MES均为过滤除菌, 倒板前加入。 MESwere filter-sterilized and added just before pouring the media into petri dishes.

表1 试验中用到的培养基及其成分 Table 1 Compositions of the media used in this study

选取饱满的玉米种子, 用70%酒精和0.1%的HgCl₂分别消毒10 min和15 min, 再用无菌水冲洗3~4遍, 接种于发芽培养基, 置光照培养箱(16 h光照, 光强80 μmol m^-2 s^-1; 8 h黑暗)和黑暗培养箱(24 h黑暗) 28℃培养。

待芽长至1~2 cm (约3 d)时, 取幼苗的芽尖、根尖和根的其他区段, 分别切成大约1 mm × 2 mm的碎片, 接种于诱导培养基, 置于28℃黑暗条件下培养, 4周后观察愈伤组织生长状况, 统计愈伤组织诱导率。将诱导出的初级愈伤组织转入继代培养基中培养, 每2周继代1次。继代2次后观察愈伤组织形态。然后转入分化培养基于光照培养箱(28℃, 16 h光照; 26℃, 8 h黑暗)中培养, 3周后分别统计分化率。分化苗长至5~10 cm时, 转入生根培养基促进生根, 待再生苗长出根后, 移栽至小盆中。

采用Microsoft Excel 2003进行数据计算及作图, 用DPS 5.12统计软件进行方差分析。

初级愈伤诱导率(%) = (初级愈伤组织总数/接种外植体总数)×100

分化率(%) = (分化出芽的愈伤组织总数/接种外植体总数)×100

再生率(%) = (再生出的植株总数/接种外植体总数)×100

每个试验均重复3次, 结果取平均值。

黑暗和光照条件下萌发的幼苗, 其根尖和芽尖均能诱导出愈伤组织, 而根的其他部位不能诱导出愈伤组织(图1-D, H, I)。其中, 光照条件下根尖和芽尖的初级愈伤组织诱导率分别为66.88%和35.74%, 而黑暗条件下分别为92.98%和54.59%。说明黑暗条件下初级愈伤组织诱导率远远高于光照条件下, 因此, 我们选取黑暗条件下萌发3 d的玉米幼苗芽尖和根尖作为外植体进行进一步研究。

图1

Fig. 1

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图1 黑暗和光照条件下玉米齐319芽尖和根尖形成的初级愈伤组织形态及诱导率的比较A, E: 分别为光照和黑暗条件下萌发的玉米种子; B, F: 分别为光照下和黑暗下萌发的幼苗的根尖形成的初级愈伤; C, G: 分别为光照和黑暗下萌发的幼苗的芽尖形成的初级愈伤; D, H: 分别为光照下和黑暗下萌发的幼苗的根的非根尖区形成的愈伤组织形成情况; I: 光照和黑暗条件下萌发的幼苗的芽尖、根尖和根毛区形成的初级愈伤组织诱导率的比较。Fig. 1 Comparison of primary callus morphology and induction rate from shoot tips and root tips of maize (Qi 319) germinated under dark and lightA, E: maize germinated in the light and in the dark, respectively; B, F: primary callus formed from root tips of maize germinated in light and dark, respectively; C, G: primary callus formed from shoot tips of maize germinated in light and dark, respectively; D, H: primary callus formed from the mature root zone of the maize germinated in light and dark, respectively; I: Comparison of primary callus induction rate of shoot tips, root tips and the mature zone of maize germinated in dark and light.

付凤玲等^{[ 17]}实验表明诱导培养基中添加适当浓度的CaCl₂有利于玉米幼胚的愈伤组织诱导, 当N₆培养基中CaCl₂浓度达到5 mmol L^-1时, 幼胚的愈伤组织诱导率最高。因此, 为了分析研究Ca²⁺浓度对芽尖、根尖愈伤组织诱导率是否具有相似的影响, 本研究在N₆诱导培养基中添加不同浓度的CaCl₂, 其终浓度分别为3、4、5和6 mmol L^-1, 并以原N₆培养基(Ca²⁺浓度为1.13 mmol L^-1)为对照, 分别选取玉米自交系齐319的芽尖和根尖接种到以上5种诱导培养基上, 4周后统计愈伤组织诱导率。结果表明, Ca²⁺对芽尖和根尖2种外植体愈伤组织诱导率的影响趋势相同, 两种外植体在Ca²⁺浓度为5 mmol L^-1的诱导培养基上初级愈伤组织诱导率都达到最高, 分别为56.67% (芽尖)和98.65% (根尖), 比对照显著提高; 当Ca²⁺浓度提高到6 mmol L^-1时, 愈伤组织诱导率开始下降(图2)。因此, 认为诱导培养基的最佳Ca²⁺浓度为5 mmol L^-1, 在此浓度下产生的愈伤组织颗粒疏散, 色泽鲜黄(图3-A, E), 比对照培养基上产生的愈伤组织更符合Armstrong等^{[ 18]}介绍的胚性愈伤组织鉴别标准。

图2

Fig. 2

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图2 诱导培养基中不同Ca2+浓度对初级愈伤组织诱导率的影响试验重复3次, *表示在 P＝ 0.05水平上差异显著。Fig. 2 Effect of different Ca2+concentrations in the induction medium on primary callus induction rateThe experiment was repeated three times. * indicates significantly different at P= 0.05.

以玉米自交系齐319为材料, 分别选取其芽尖和根尖来源的胚性愈伤组织(图3-A, E)接种于分化培养基上培养并观察其愈伤组织分化情况。结果显示, 26.17%的芽尖和25.78%的根尖均能分化出芽(表2, 图3-C, G), 并可以成功实现再生(图3-D, H), 芽尖和根尖的植株再生率分别达到35.00%和38.48% (表2)(部分分化的愈伤组织一个可以再生出多棵植株)。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 不同玉米外植体来源的愈伤组织诱导率及分化率比较 Table 2 Induction rate and differentiation rates of the callus from the different maize explants 外植体 Explant 接种数目 Total No. of inoculation 初级愈伤组织诱导率Primary callus induction rate (%) 胚性愈伤组织诱导率Embryogenic callus induction rate (%) 分化率 Differentiation rate (%) 植株的再生率 Plant regeneration rate (%) 芽尖Shoot tips 480 55.67 30.21 26.17 35.00 根尖Root tips 330 98.65 38.79 25.78 38.48

表2 不同玉米外植体来源的愈伤组织诱导率及分化率比较 Table 2 Induction rate and differentiation rates of the callus from the different maize explants

图3

Fig. 3

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图3 来源于玉米自交系齐319的芽尖和根尖的再生过程A, E: 分别为芽尖和根尖形成的愈伤组织; B, F: 分别为芽尖和根尖形成的愈伤形态; C, G: 分别为分化出芽的芽尖和根尖来源的愈伤组织; D, H: 分别为根尖和芽尖诱导再生的小苗。Fig. 3 Regeneration process from shoot tips and root tips of maize seedlings of maize inbred line Qi 319A, E: Primary callus from shoot tips and root tips respectively; B, F: Callus morphology from shoot tips and root tips respectively; C, G: Cluster buds differentiated from callus formed from shoot tips and root tips respectively; D, H: Regenerated plantlet from shoot tips and root tips respectively.

为了研究不同基因型对芽尖和根尖这2种外植体的愈伤组织诱导率、愈伤组织形态及愈伤组织分化率的影响, 除齐319外, 我们又选择了5个基因型的玉米幼苗, 对其芽尖和根尖的再生性进行比较。结果显示, 6个自交系的芽尖和根尖均能产生愈伤组织, 不同基因型的两种外植体产生的初级愈伤组织频率趋势基本相同, 根尖诱导愈伤组织比芽尖的高, 其中齐319、鲁原92的2种外植体初级愈伤组织诱导率, 分别为97.62% (齐319根尖)和54.59% (齐319芽尖), 91.32% (鲁原92根尖)和51.04% (鲁原92芽尖)(图4-A), 相对较高。

尽管6个玉米自交系的根尖的初级愈伤组织诱导率比芽尖的高, 但是其胚性愈伤组织诱导率和芽尖相比差异并不像初级愈伤组织诱导率那么显著(图4-B), 不同基因型的两种外植体产生的胚性愈伤组织的趋势也基本相同, 同种基因型的根尖的胚性愈伤组织诱导率和芽尖相似或比芽尖的稍高一些。其中齐319的两种外植体的胚性愈伤组织相对于其他6个自交系都比较高, 分别达到38.79% (根尖)和30.21% (芽尖)(图4-B)。

图4

Fig. 4

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图4 不同基因型对芽尖和根尖愈伤组织诱导率和胚性愈伤组织分化率的影响A: 6种不同基因型玉米自交系的两种外植体的初级愈伤组织诱导率的比较; B: 6种不同基因型玉米自交系的2种外植体的胚性愈伤组织诱导率的比较; C: 6种不同基因型玉米自交系的2种外植体的分化率的比较。Fig. 4 Callusing and differentiation rates of shoot tips and root tips from six genotypes of maize inbred linesA: Comparison of the primary callus rate of two explants from six genotypes of maize inbred lines; B: Comparison of the embryogenic callus induction rate of two explants from six genotypes of maize inbred lines; C: Comparison of the differentiation rate of two explants from six genotypes of maize inbred lines.

为评价愈伤组织的继代能力和形成愈伤组织的质量, 将6个基因型的芽尖和根尖形成的初级愈伤组织分别接种到继代培养基上, 2周继代一次, 继代2次后观察芽尖和根尖形成的愈伤组织形态。6个自交系形成的愈伤组织主要分为3种类型, 其中齐319和鲁原92形成的愈伤组织多数为淡黄色, 生长旺盛, 颗粒疏散, 更符合Bajaj^{[ 19]}对II型愈伤组织的鉴别标准。Mo17多数形成I型愈伤组织, 大部分不能长期继代; 昌7-2、178和478形成的愈伤组织结构松软, 且水渍化严重, 继代中容易褐化死亡(表3)。最后分别选取6个基因型来源的芽尖、根尖形成的胚性愈伤组织, 接种到分化培养基上, 2周后统计分化率, 结果显示, 同基因型的芽尖、根尖形成的胚性愈伤组织分化率差异不显著, 不同基因型的这两种外植体来源的胚性愈伤组织分化率趋势也基本相同(图4-C)。