截止2010年新疆已审定的陆地棉品种98份, 本研究共收集94份品种。这些品种包括新陆早系列49份、新陆中系列44份和军棉1号, 品种来源于各育种家、育种单位及巴音郭楞蒙古自治州农业科学所种质资源保存库(见附表1)。

采集新鲜幼嫩叶片, 采用改良的CTAB法提取棉花基因组DNA^{[ 11]}。以100 bp DNA Ladder作对照, 1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和完整性。用Nanodrop-ND-1000全波长紫外/可见光扫描分光光度计检测DNA浓度, 用ddH₂O逐一将模板DNA稀释为所需浓度备用。

根据Xiao等^{[ 12]}, 随机选择分布于棉花26条染色体的SSR标记, 遗传图谱大小约4140 cM, 以每20 cM间距选择已定位于染色体的SSR标记共计206对, 引物序列等信息均来自(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/和http://www. cottondb.org/)。引物包括DPL、CGR、CER、DC、BNL和JESPR等类型, 由生工生物工程(上海)有限公司合成。

PCR反应体积10 μL, 含20 ng μL^-1模板DNA 1 μL, 10 mol L^-1dNTPs 0.2 μL, 20 ng μL^-1引物1 μL, 5 U Taq Polymerase 0.2 μL, 10×buffer 1 μL。使用Gene Amp PCR System 9700进行扩增, 扩增条件为 94℃预变性5 min; 94℃变性35 s, 50℃(根据引物退火温度改变)退火35 s, 72℃延伸50 s, 共30次循环; 72℃延伸7 min。使用DYY-6C型稳压稳流电泳仪, 用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增产物, 恒定电压180 V, 电泳70 min, 银染观察并照相。

根据PCR扩增产物的电泳结果采用0-1系统记录谱带位置, 观察某一扩增条带的有无, 有带记为1, 无带记为0。

利用NTSYS-pc 2.11软件进行遗传多样性分析。Simpson’s多样性指数也称位点多态信息量(PIC), PIC=1-∑ P_i²; Simpson-Weaver多样性指数也称基因型多样性( H°), H°= -∑ P_i ln P_i; 每个位点的有效等位基因数为 Ne=1/∑ P_i², P_i为第 i个等位基因变异出现的频率。

根据SSR标记统计的0、1数据结果, 利用NTSYS2.11软件, 采用Jaccard’s相似系数计算两两品种间的遗传相似系数, 得到相似系数矩阵。根据Nei和Li’s的公式计算遗传相似系数=2 N_xy/( N_x+ N_y)。 N_xy指材料 x和 y之间共同的等位变异, N_x指 x材料所具有的等位变异数, N_y指材料 y所具有的等位变异数。采用类平均法(UPGMA), 对遗传相似系数矩阵进行聚类。

选用206对SSR引物, 对遗传背景和田间性状差异较大的8个品种进行初步筛选, 得到54对扩增效果好、条带差异明显的SSR引物, 用于94份品种SSR分析。

用筛选的54对引物(见附表2)共检测出153个等位变异, 引物等位位点数为2~6个, 平均每对引物2.93个。其中, 引物DPL0111和DPL0522的有效等位基因数最多为6个, 其次为引物BNL1161和DPL0022, 为5个。检测的基因型数共160个, 平均每个多态位点的基因型数为2.96个。每个位点的平均遗传多样性指数为0.4491, 变幅为0.0439~0.7149。引物多态性信息量(PIC)的变化范围为0.0430~0.6640, 平均为0.3831, 可以反映较丰富的遗传多样性信息。

Jaccard’s相似系数矩阵(表略), 94份新疆陆地棉品种间成对遗传相似系数变幅为0.3846~0.9835。其中相似系数最大的2个品种是新陆早29和新陆早39, 相似系数为0.9834, 这2个品种都含有美棉贝尔斯诺的遗传背景。分子标记相似性结果很好地验证了它们之间的亲缘关系。相似系数最小的2个品种是新陆中11和新陆中35, 相似系数为0.3846, 还有新陆早19和新陆中33 (0.400), 新陆早37与新陆中8号(0.4095), 新陆中19和新陆中33 (0.4343), 新陆中8号和新陆中39 (0.4356), 这些品种间相似性都很小, 表明它们之间的亲缘关系较远。

将94份新疆陆地棉品种的成对相似系数个数分为7个区间统计(表1)显示,在0.601~0.700区间的有1451个, 占总数的33.20%; 在0.701~0.800区间的1691个, 占总数的38.69%; 即71.90%的相似系数均在区间0.601~0.800内。而在0~0.400之间的相似系数仅有2个, 占总数的0.05%。说明新疆陆地棉品种间的遗传相似性相对较高, 总体上遗

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 94个品种间相似系数 Table 1 Number of similarity coefficient among the 94 cultivars 区间 Range 相似系数个数 Number of coefficient 所占比例 Propotion (%) 0-0.400 2 0.05 0.401-0.500 148 3.39 0.501-0.600 774 17.71 0.601-0.700 1451 33.20 0.701-0.800 1691 38.69 0.801-0.900 291 6.66 0.901-1.000 14 0.32

表1 94个品种间相似系数 Table 1 Number of similarity coefficient among the 94 cultivars

传多样性不够丰富。

以SSR分子标记多态性数据计算的成对相似系数和采用类平均法(UPGMA)的聚类分析, 结果如图1所示。在阈值为0.63时, 将94份新疆自育陆地棉品种划分为2个类群(1和2)。

第一类群包括69个品种, 其中新陆早系列品种有36个, 新陆中系列品种有33个。第一类群从整体上虽不能明显划分为几个亚类群, 但也有一定的规律性。例如, 新陆早和新陆中品种在聚类图上各自聚集相对集中。

新陆中品种聚集相对集中的区域(聚类分支较多)中, 新疆生产建设兵团农一师农业科学研究所选育的新陆中24、新陆中43和新疆康地种业科技股份有限公司选育的新陆中31均具有海岛棉背景的三系杂交棉, 各自聚成一个分枝。新陆中3号、新陆中5号、新陆中12各自聚成一类, 它们都含有前苏棉血统108夫的血统, 另外在这些零散的分枝中还包括康地种业选育的新陆早34。由新疆农业大学选育的2个中长绒棉品种新陆中13、新陆中15和巴音郭楞蒙古自治州农业科学研究所选育的新陆中41、新陆中47也被聚在这一大类中。新陆中18、新陆中28、新陆中37、新陆中46分别含有冀9119和辽棉10号、中棉所35、渝棉1号和中棉所12的遗传背景, 也被分别聚成一类。从整体看这部分材料遗传基础背景相对丰富, 因此聚类图也表现出分支较多。

以新陆早品种聚集较为集中的区域品种分类较为明显, 也更有规律性。纤维品质较好的品种被聚在一起, 例如由万氏棉花种业有限公司选育的中长绒棉新陆早31、新陆早39和新陆早29被聚在一个分支, 它们都含有美棉贝尔斯诺的遗传组分, 另外新陆早24也是中长绒棉品种, 新陆早47的纤维品质也很好。由新陆早16作为相同亲本选育的新陆早20、新陆早35、新陆早49聚在一起, 它们共同含有美棉贝尔斯诺遗传组分。相同育种单位选育的不同品种也很好地聚在一起, 例如由农一师农业科学研究所选育的新陆中7号、新陆中14被聚在一起, 它们分别有中棉所12、中棉所19的遗传背景; 由新疆兵团农垦科学院选育的新陆早32、新陆早33和新陆早42, 巴州农业科学研究所选育的新陆中1号、新陆中11, 新疆石河子棉花研究所选育的新陆早14、新陆早19和新陆早46均被聚类在一起; 新疆生产建设兵团农七师农业科学研究所选育的新陆早3号、新陆早9号、新陆早13、新陆早15也被聚在一起(其中新陆早3号、新陆早15为低酚棉品种), 这些品种大都含有中棉背景的遗传组分^{[ 1]}。另外新陆早1号、新陆早2号、新陆早5号、新陆早7号、新陆早8号、新陆早10号均被聚类在一起, 其中由石河子棉花研究所选育的新陆早2号、新陆早5号、新陆早8号和新陆早1号这些早期选育的品种大都有前苏棉品种611波的遗传背景, 新陆早7号、新陆早10号则有塔什干2号和乌干达4号的遗传背景。

从第一类群69个品种的聚类结果可以看出, 具有相似遗传基础、相同育种单位和相同类型的品种均被聚在一起, 并表现出明显的规律性, 一些聚类结果与表型聚类吻合度很高。69个品种中早期选育的品种与前苏棉品种塔什干2号、611波、克克1543、108夫等有很强的血缘关系, 中后期选育的品种则更多地表现出美棉和黄河生态型遗传背景。如大部分品种都含有岱字棉15、爱字棉、贝尔斯诺、中棉所4号、中棉所12、中棉所17、中棉所19和中99等遗传基础, 而中棉所大部分品种遗传背景则集纳了美棉岱字棉、金字棉、斯字棉、爱字棉等血统, 因此, 第一类群中品种间的遗传基础随着时间的推移逐渐拓展和丰富, 由前苏棉遗传背景逐渐向美棉等遗传背景转变^{[ 13]}。

第二类群包括25个品种, 其中新陆早系列品种有13个, 新陆中系列品种有12个。军棉1号和新陆中9号有司450的遗传背景, 被聚在第二大类群, 新陆中4号、新陆中6号有司1470的遗传背景, 被聚在一起。新陆早6号、新陆早22拥有塔什干2号的遗传背景, 也被聚在第二类群, 新陆早6号、新陆早16、新陆早22、新陆早25共同含有贝尔斯诺的遗传组分, 阿拉尔良繁场选育的新陆中16、新陆中17聚在第二类群中, 他们都有中棉所17的遗传背景, 而中棉所17含有岱字棉15的血统。另外新陆早4号、新陆早26分别有克克1543、611波的遗传背景, 新陆中2号有司4757的遗传背景, 均聚在同一类群。另外新陆中33、新陆早23、新陆早37、新陆早45分别有渝棉1号、黑山棉1号(来源于金字棉)、辽棉和中无5601等遗传背景, 都被聚在第二类群中。除了具有相同的遗传组分, 相同育种单位和相同类型的品种也被聚在一起。如新疆农业科学院经济作物研究所选育的新陆早17、新陆早18、新陆中2号、新陆中4号、新陆中9号就被聚在第二类群, 农七师农业科学研究所选育的新陆早4号、新陆早6号、新陆早16、新陆早25大都有贝尔斯诺的遗传背景, 被聚在一起, 巴州新科种业选育的新陆中33、新陆中35也聚在一起, 另外2个杂交棉新陆早44和新陆中39同时被聚在第二类群。结果显示第二类群中更多品种含有前苏棉生态类型的血统。

供试品种遗传系谱及遗传分析表明, 涉及的亲本和历经的育种世代数较少, 特别是涉及不同生态型、不同遗传组分的亲本及有性杂交世代数较少。每个品种遗传系谱平均涉及不同亲本5个左右, 有性杂交世代4代左右(包括回交世代), 涉及的亲本又大多为同一基础遗传组分、生态型差异小的品种。一些品种又直接从自育出的品种中系选或将其作为亲本选育而成, 表现遗传系谱简单, 品种间亲缘关系较近, 遗传基础明显狭窄。

20余个自育品种遗传系谱中涉及的亲本为前苏棉生态型的品种, 且数量有限, 一些品种的系谱涉及的亲本大多相同、集中在某几个, 如北疆棉区自育品种(新陆早1号、新陆早2号、新陆早3号、新陆早4号、新陆早5号、新陆早6号、新陆早7号、新陆早8号)大都带有苏棉KK-1543、611波、塔什干2号等亲缘关系, 南疆棉区自育品种新陆101、新陆102、新陆202、军棉1号及新陆中1号、新陆中 2号、新陆中3号、新陆中4号、新陆中5号、新陆中6号、新陆中7号、新陆中8号、新陆中9号、新陆中12大都含有苏棉KK1543、108夫、C-1470等亲缘。有些品种的回交亲本也为苏棉生态型, 表明新疆自育品种的遗传组分具有较强苏棉生态系统的遗传组分, 遗传组分结构表现极为单一, 选育出的品种间遗传组分差异极小, 这是新疆棉花自育品种遗传基础的现状、特点。另外, 新疆棉花自育品种在具备新疆生态型特点基础上, 明显表现出苏棉品种遗传组分特点。从形态上表现为铃大、衣分低、籽指大、早熟、个体小、果枝短、蕾铃脱落率高。这些特点有其优势也有其不足, 特别是随着生产的发展, 衣分低、蕾铃脱落率高、蕾铃时空分布过于狭窄的遗传组分特点, 不适应棉花产量进一步提高。

通过系谱背景不难看出, 从20世纪70年代末80年代初新疆自育第1个品种军棉1号和新陆早1号至今20余年中, 新疆棉花育种遗传基础明显狭窄, 基础遗传组分的拓展方向以苏棉生态型为主。“九五”计划后, 新疆棉花育种工作者虽然认识到这一问题, 增加了一些抗性好、品质好的美棉和黄河生态型亲本, 如新陆早23、新陆早37、新陆早45分别含有黑山棉1号(来源于金字棉)、辽棉和中无5601的遗传背景, 新陆中18、新陆中28、新陆中33、新陆中37、新陆中46分别含有冀9119和辽棉10号、中棉所35、渝棉1号和中棉所12的遗传背景^{[ 22]}, 但遗传基础狭窄的问题未根本改变。

利用SSR标记开展棉花遗传多样性研究, 首先要考虑选择的标记是否覆盖棉花全基因组并且相对均匀分布, 避免盲目性, 否则所获得的试验结果反映的只是供试材料在基因组特定或部分区域的遗传多样性, 会影响试验结果的准确性^{[ 14]}。根据Xiao等^{[ 12]}发布的棉花遗传连锁图谱, 本研究以每20 cM为间距, 筛选已定位于棉花26条染色体(遗传图谱大小约4140 cM)的SSR标记总计206对; 通过筛选确定出54对多态性好的SSR引物, 这些引物分布在棉花的21条染色体上(第4、第7、第15、第17、第24染色体除外), 覆盖了染色体总数的80.8% (21/26), 其中第6和第20染色体包含的标记数最多(含有5个SSR标记)。另外, 本文筛选的54对标记均已有定位QTL报道。因此, 本研究结果基本反应了94份品种在全基因组水平内存在的差异和多样性。

图1

Fig. 1

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	图1 94个品种基于SSR的聚类图B: 新陆早; N: 新陆中; N0: 军棉1号。Fig. 1 Dendrogram of 94 different cultivars based on SSR dataB: Xinluzao; N: Xinluzhong; N0: Junmian 1. Numbers correspond with the number of cultivars given in Supplementary Table 1.

另外研究表明, 试验选取引物的数量对聚类分析结果影响较大, 因此要提高研究结果的准确性, 应当尽可能多地选择均匀分布于棉花全基因组的SSR标记^{[ 15]}, 虽受试验条件、成本等因素的限制, 但筛选出多态性好的SSR标记能覆盖全部连锁群, 试验研究结果将更加理想。

新疆自育陆地棉品种间分子聚类结果与品种本身遗传系谱背景和演变趋势吻合度较高, 符合品种本身的真实特性。具有相近表型性状、相同遗传基础背景、相同类型和相同育种单位选育的品种聚在同一类群和分枝。一方面说明新疆不同育种单位在常年选育过程中积累形成了各自的优势、特点和育种方向, 呈现一定规律性; 另一方面也说明同一育种单位选育的品种被聚在一类的原因与育种单位种质资源的单一性密切相关。

从新疆南北疆经历的几次大的品种更迭不难看出, 每一次品种更换, 都代表着新疆自育品种遗传组分发生着一次明显变化。

从20世纪70年代以来, 北疆(特早熟棉区)棉花品种面积、总产和单产有了大幅度地提高, 产量的增加与新优良品种的推广应用有直接作用。北疆棉花主栽品种大致经历了4次品种更换, 从品种更换过程中占据主栽地位的代表品种可以看出(新陆早1号、新陆早7号、新陆早8号、新陆早12、新陆早13、新陆早24、新陆早36、新陆早42、新陆早48等), 其推广面积最高峰都在每年10万公顷以上, 在当时的生产中发挥了极其显著的作用。究其遗传原因, 在于北疆棉花育种较早地合理拓展了含有美棉成分的遗传组分。从品种遗传背景不难看出, 北疆棉区自育品种(新陆早1号、新陆早2号、新陆早3号、新陆早4号、新陆早5号、新陆早6号、新陆早7号、新陆早8号)大都带有苏棉KK-1543、611波、塔什干2号等亲缘关系^{[ 13]}, 品种遗传基础相对狭窄; 在之后的育种过程中, 北疆主栽品种逐渐呈现多元化趋势, 既有自育品种也有引进品种, 而自育品种遗传组分表现出了相对丰富等特点。尤其是输入美棉血统^{[ 20]}(贝尔斯诺、岱字棉、爱字棉、金字棉等)、黄河流域中棉系列以及特早熟棉区辽棉系列品种的遗传组分, 使北疆自育品种的遗传基础不断拓展和丰富, 产量不断提高, 同时也为新疆棉花育种打破遗传组分狭窄问题提供了启示、依据和拓展方向。这些更换时期的代表品种也恰好被分子聚类在第一类群, 从品种系谱、SSR标记聚类结果和推广应用面积3个方面得到相互印证。

自20世纪70年代末至今, 南疆棉花品种也经历了4次更换。其中, 新疆自育审定的第一个陆地棉品种军棉1号在随后近20年时间里一直成为南疆棉花主栽品种, 累计推广面积超过了200万公顷。以军棉1号为代表的自育陆地棉品种取代原苏联系列生态型品种108夫、C-1470、KK-1543等, 这次品种更换遗传组分演变虽然仍以苏棉生态型品种遗传组分为主, 但军棉1号遗传组分明显较原苏棉品种的遗传组分拓宽了许多。首先表现为军棉1号通过多父本杂交在遗传组分中较全面地集纳了多个苏棉品种和自育品种C1470、C3521、大铃棉、2依3等遗传组分; 其次是拓展输入了具有海岛棉遗传背景的新海棉遗传组分, 同时输入了具有早熟特性的早落叶品种的遗传组分。这些遗传组分的拓展, 使军棉1号稳产性、适应性、早熟性及纤维品质均得到明显提高。军棉1号品种遗传系谱的世代数多、杂交代数多、涉及的亲本多、涉及亲本的生态型和遗传多态性多, 杂交亲本的生态特点趋近于本地区的生态特点, 遗传基础丰富。

种质资源的不丰富导致了自育品种遗传基础的来源受限, 从而使得选育的品种遗传组分差异较小, 品种相似度较高。因此遗传基础的狭窄与品种本身材料来源狭窄密切相关, 这一点与前人对中国陆地棉种质资源的遗传基础狭窄的研究结论一致^{[ 16, 17, 18, 19]}。如别墅等^{[ 16]}对我国三大主产棉区30个有代表性的品种遗传多样性研究指出, 我国棉花大多数品种的遗传基础比较狭窄。陈光^{[ 17]}对我国陆地棉基础种质和衍生系遗传多样性及亲缘关系分析表明基础种质基因组水平的差异呈下降的趋势, 暗示我国棉花的育种背景逐渐变窄。杜雄明等^{[ 18]}对陆地棉基础种质遗传多样性分析的结果表明现代基础种质比早期基础种质在基因组水平的差异呈下降的趋势。薛艳等^{[ 19]}对北疆42个新陆早聚类分析发现, 品种在DNA水平上彼此间的差异并不是很大, 绝大多数供试品种的亲缘关系比较近, 遗传基础比较狭窄。

新疆自育品种SSR标记的聚类分析结果与其生态型特点也是吻合的。新疆棉花自育品种在具备新疆生态型特点基础上, 明显表现出苏棉品种遗传组分特点。从形态上表现为铃大、衣分低、籽指大、早熟、个体小、果枝短、蕾铃脱落率高。这些特点有其优势也有其不足, 特别是随着生产的发展, 衣分低、蕾铃脱落率高、蕾铃时空分布过于狭窄的问题明显暴露出来。

如何改变目前自育品种遗传基础狭窄现状, 最根本的途径就是努力拓宽遗传基础材料的来源。在今后育种中既要发挥各育种单位的育种优势, 也更应加强互相交流, 汲取其他单位育种的优点, 取长补短, 互通有无以提高自身选育品种的遗传基础。

致谢: 感谢巴州农业科学研究所种质资源保存库李卫平、阿同古丽; 新疆农垦科学院余渝; 农七师农业科学研究所黄丽叶; 石河子棉花秦江鸿、尤春源以及刘奇峰、郭江平、李琴等老师给予的大力支持和帮助。感谢中国农业大学王晓翠、文婷、商连光等同学的真诚帮助。