大肠杆菌( Escherichia coli) DH5α、根癌农杆菌( Agrobacterium tumefaciens) EHA105、质粒pBEOM、pCGEM均由东北农业大学农业生物功能基因重点实验室保存。

利用 EcoR I单酶切载体pCGEM, 得到 SCMRP基因, 连接到含有 CBRLK基因的表达载体pBEOMCBRLK上。鉴定连接正反向, 构建双价基因( GsCBRLK-SCMRP)组成型植物表达载体pBEOCBRLK-SCMRP。采用冻融法将重组质粒导入农杆菌EHA105, 用于苜蓿的遗传转化。

以8日龄无菌苗的子叶节为外植体, 在盛慧等^{[ 25]}苜蓿转化方法的基础上略改进, 用0.5 mg L^-1草铵膦(glufosinate-ammonium, 购自Sigma公司)为筛选剂。将再生植株移栽到草炭土∶沙土=2∶1的花盆中, 于温室培养(24℃, 600 μmol s^-1m^-2, 16 h d^-1光照, 80%相对湿度)。

以转基因苜蓿叶片DNA为模板, 根据 SCMRP基因的全长序列设计特异引物MVP-S和MVP-AS (5°-CAGCAGGGTCTCGCTTCACT-3°和5°-GCAGAT TCCAATGCCACAAT-3°)进行PCR检测。PCR产物长度为358 bp。

选取PCR阳性的转基因株系, 进行 GsCBRLK- SCMRP双价基因转录水平分析。参照RNAprep Pure Plnat Kit (TIANGEN, 北京)提取苜蓿叶片总RNA。取2 μg总RNA, 应用SuperScript III Reverse Transcriptase (Invitrogen, USA)合成cDNA第一链。以 GsCBRLK-SCMRP基因的特异引物GsCBRLK-SQ-S, GsCBRLK-SQ-AS (5'-GCACCAGGGAGACAACCA CG-3'; 5'-CATATGTCTTATGCCTATTCTTCCTACC-3')和MVP-S, MVP-AS进行半定量RT-PCR。以苜蓿GPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GenBank登录号为MTR_4g131180)为内参基因, 引物为S: 5'-GTGGTGCCAAGAAGGTTGTTAT-3'和AS: 5'-CTGGGAATGATGTTGAAGGAAG-3'。

取RT-PCR阳性植株进行Western blot检测。在蛋白的N-末端设计GsCBRLK编码蛋白特异性多肽(N-Term: KKTPAPSLHQSNQRQKNC), 委托哈尔滨赛拓生物公司合成及制备多克隆抗体。参见陈富成等^{[ 26]}的方法, 提取植物叶片总蛋白, 并进行Western blot检测^{[ 27]}。以野生大豆总蛋白为阳性对照, 非转基因苜蓿总蛋白为阴性对照。目标蛋白约为50 kD。

剪取带有2~3个节点的茎段扦插扩繁。待茎段生根后, 选取生长状态良好且一致的扩繁苗, 移栽到含有蛭石∶珍珠岩=1∶1的小钵中, 分别用含有100 mmol L^-1和150 mmol L^-1 NaHCO₃的1/8 Hoagland营养液(pH值分别为8.0和8.5)处理, 每2 d更换一次营养液, 14 d后观察记录表型。

采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法测定丙二醛(MDA)含量^{[ 28]}。采用NBT比色法^{[ 29]}检测SOD酶活性, 以抑制NBT氧化还原50%消耗的酶为1个活性单位。参照Gibon等^{[ 30]}的方法, 用DDSJ-308A电导率仪(中国上海)检测相对质膜透性。

取苜蓿地上部分材料, 于烘箱105℃下杀青15 min, 80℃烘至恒重; 将烘干的样品粉碎过60~80

目筛, 称样100 mg; 加6 mol L^-1HCl 6~8 mL, 充氮气, 封口; 110℃烘箱水解22 h; 冷却, 摇匀过滤, 以双蒸水定容至50 mL, 润洗3次以上; 取1 mL将其冻干并加0.02 mol L^-1HCl溶液1 mL振荡摇匀; 以18 407× g离心15 min, 吸上清0.8 mL, 过0.45 μm滤膜后上机检测^{[ 31]}。用全自动氨基酸分析仪(日本日立, 型号L-8800)测量氨基酸含量。

双价基因组成型植物表达载体pBEOCBRLK- SCMRP (图1)使用烟草花叶病毒CaMV35S启动子分别调控双价基因, 以 bar基因作为筛选标记基因。使用能增强翻译的omega调控元件及E12增强子^{[ 32]}, 有利于外源基因在受体植物中的高效表达。

采用农杆菌介导法转化苜蓿, 对草铵膦筛选得到的抗性植株进行PCR鉴定, 获得PCR阳性植株55株。阳性对照和转基因植株中均扩增出大小为358 bp的目的片段, 而阴性对照中无扩增带(图2)。

图1

Fig. 1

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	图1 植物表达载体pBEOCBRLK-SCMRP结构图谱Fig. 1 Sketch map of plant expression vector pBEOCBRLK-SCMRP

图2

Fig. 2

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	图2 转基因苜蓿PCR分析M: DL2000 marker; -: 阴性对照; NT: 非转基因株; +: 阳性对照; 1~23: 部分转基因株系。Fig. 2 PCR analysis of transgenic alfalfa leafM: DL2000 marker; -: negative control; NT: non-transgenic plants; +: positive control; 1-23: partial transgenic lines.

为了筛选 GsCBRLK基因超量表达的转基因苜蓿, 随机选取5个PCR阳性植株进行半定量RT-PCR检测(图3)。结果显示, GsCBRLK和 SCMRP2个基因在转基因苜蓿中均能超量表达, 而非转基因对照株系中未检测到阳性信号。

图4显示, 1~5号转基因株系均有50 kD大小的免疫印迹条带, 表明 GsCBRLK基因已经转入苜蓿中并能正常表达。

由于紫花苜蓿是典型异花授粉四倍体植物, 通过种子繁殖难以获得遗传稳定的纯合体, 本研究采用茎节扦插扩繁的方式, 获得大量可用于耐碱性分析的材料。从RT-PCR阳性株系中选取表达量较高的2个株系CS-16和CS-21进行表型分析。在未处

图3

Fig. 3

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	图3 转 GsCBRLKand SCMRP基因苜蓿半定量RT-PCR分析NT: 非转基因株; 1~5: 转基因株系, 其中4道为CS-16, 5道为CS-21。Fig. 3 RT-PCR analysis of GsCBRLKand SCMRP expressions in leaf of transgenic alfalfaNT: non-transgenic plants; 1-5: transgenic plants, includinglines CS-16 (lane 4) and CS-21 (lane 5).

图4

Fig. 4

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	图4 转基因苜蓿Western blot分析NT: 非转基因株; +: 阳性对照; 1~5: 转基因株系; 其中4道为CS-16, 5道为CS-21。Fig. 4 Western blotting analysis of transgenic alfalfaNT: non-transgenic plants; +: positive control; 1-5: transgenic plants, includinglines CS-16 (lane 4) and CS-21 (lane 5).

理条件下, 转 GsCBRLK基因苜蓿与非转基因苜蓿的生长状态并无明显差异(图5-A), 100 mmol L^-1和150 mmol L^-1NaHCO₃处理14 d后, 转基因株系CS-16和CS-21的生长状态明显好于非转基因对照(图5-B, C)。经150 mmol L^-1NaHCO₃处理后, 差异更明显, 转基因株系CS-16和CS-21虽受轻度影响, 但均能保持良好的生长状态, 而非转基因对照株系则明显萎蔫、失绿甚至死亡(图5-C)。

胁迫处理前后植株的株高和生物量(图6)表明, 所有株系的株高随碱处理浓度的增大而逐渐下降, 但转基因株系CS-16和CS-21的下降幅度均小于非转基因株系, 而在150 mmol L^-1NaHCO₃处理条件下, 转基因株系CS-16和CS-21的株高分别是40.58 cm和40.81 cm, 较非转基因株系34.35 cm有显著差异( P<0.05)。同样, 各株系地上部分及根系的鲜重, 经过碱胁迫处理后均有所下降, 但2个转基因株系的生物量均显著地高于非转基因对照( P<0.05)。由此进一步说明转 GsCBRLK基因苜蓿具有较强的耐碱能力。

图5

Fig. 5

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	图5 转基因苜蓿碱胁迫表型分析A: 无胁迫对照; B和C: 100和150 mmol L-1 NaHCO3处理14 d; NT: 非转基因株; CS-16和CS-21: 转基因株系。Fig. 5 Phenotypes of transgenic alfalfa under alkali stressA: no stress control; B and C: 100 and 150 mmol L-1 NaHCO3 treated for 14 days; NT: non-transgenic plants; CS-16 and CS-21: transgenic lines.

2.3.1 NaHCO₃胁迫对苜蓿叶片细胞膜透性的影响

图7-A表明, 随着NaHCO₃胁迫浓度的增加, 转基因和非转基因株系的MDA含量均随之增加, 在高pH值(pH 8.5)处理下, 2个转基因苜蓿株系的MDA含量增加幅度显著低于非转基因对照( P<0.05), 从而说明超量表达 GsCBRLK基因可降低NaHCO₃胁迫对细胞膜造成的氧化损伤。

相对质膜透性是反映细胞膜伤害程度的另一重要指标。图7-B表明, 转基因和非转基因苜蓿相对质膜透性均随NaHCO₃胁迫浓度的增加而升高, 但在150 mmol L^-1NaHCO₃处理下, 2个转基因株系相对质膜透性的增加幅度与未转基因对照差异显著( P<0.05)。结合MDA的结果, 说明NaHCO₃胁迫会加速膜脂氧化, 并对细胞膜造成损害, 而 GsCBRLK基因的超量表达, 减弱细胞膜的损伤及膜脂氧化程度, 从而提高苜蓿的耐碱能力。

2.3.2 NaHCO₃胁迫对苜蓿SOD活性的影响 图8表明, 正常条件下, 转基因和非转基因株系的SOD活性没有显著差异, 但在NaHCO₃胁迫条件下, 转基因和对照株系的SOD活性均有提高, 当NaHCO₃浓度达100 mmol L^-1时差异极显著( P<0.01)。说明

图6

Fig. 6

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	图6 NaHCO3胁迫对转基因苜蓿株高和生物量的影响柱形上不同字母表示相同处理条件下株系间有显著差异( P<0.05)。Fig. 6 Changes of plant height and biomass of transgenic alfalfa under NaHCO3 stressDifferent letters above columns indicate significant difference among lines under the same condition ( P<0.05).

图7

Fig. 7

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	图7 转基因苜蓿的MDA含量及相对质膜透性柱形上不同字母表示相同处理条件下株系间有显著差异( P<0.05)。Fig. 7 MDA content and relative membrane permeability of transgenic alfalfaDifferent letters above columns indicate significant difference among lines under the same condition ( P<0.05).

图8

Fig. 8

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	图8 碱胁迫下转基因苜蓿的SOD活性标以不同字母表示在 P<0.01水平上差异显著。Fig. 8 SOD activity in transgenic plant under NaHCO3 stressBars superscripted by different letters are significantly different at the 0.01 probability level.

较低浓度NaHCO₃胁迫即可调控SOD的活性以增强活性氧清除的能力, 而 GsCBRLK基因超量表达极大提高了转基因株系的SOD活性, 降低了碱胁迫对植株造成的氧化伤害。

分析了转基因及非转基因苜蓿叶片中16种氨基酸含量(表1)。2个转基因株系甲硫氨酸含量均比较未转基因对照高, 但天冬氨酸含量分别降低1.03%和1.02%, 说明转基因株系中 SCMRP基因的超量表达增加了苜蓿叶片中甲硫氨酸的含量。至于天冬氨酸含量下降的原因还有待进一步研究。