*通讯作者(Corresponding author): 李洪杰, E-mail:lihongjie@caas.cn
第一作者联系方式: E-mail:celestial99@163.com
**同等贡献(Contributed equally to this work)
汶农14是近年山东省和国家审定的一个半冬性小麦品种。采用来自不同地区的52个小麦白粉菌菌株对汶农14进行抗性鉴定, 并利用分子标记定位了其抗白粉病基因。汶农14对43个菌株(82.7%)表现抗病反应型, 对9个菌株表现感病反应型。这些菌株对汶农14的毒力谱与已知抗白粉病基因
Wennong 14 is a facultative wheat cultivar commercialized in Shandong province and the neighbouring provinces in the northern part of Yellow and Huai River Valleys Facultative Wheat Zone in China. In this study, an array of
小麦白粉病(病原菌为 Blumeria graminis f. sp. tritici)在世界上很多小麦产区普遍发生[ 1]。白粉病在我国冬麦区和春麦区均有危害, 尤其在冬麦区造成的产量损失更大, 是我国小麦( Triticum aestivum L.)生产上的一种重要流行性病害, 2013年全国发病面积估计为680万公顷(http://cb.natesc.gov.cn/sites/cb/)。小麦白粉病在我国蔓延的主要原因包括: (1)矮秆、高产、感病品种的广泛种植, 增大了田间植株群体的密度; (2)灌溉条件和生产条件的改善, 增大了田间的湿度; (3)白粉菌毒力结构的变异, 导致抗病基因失效, 而感病品种的大面积种植为白粉菌的增殖提供了寄主条件。白粉病对小麦生产造成经济损失不仅在于产量的降低, 而且还会导致加工品质和烘烤品质的下降[ 2, 3]。
利用抗病品种控制小麦白粉病一方面可以降低生产成本, 另一方面还可避免化学药剂施用带来的环境问题。白粉病在我国的流行始于20世纪70年代, 早期抗白粉病育种主要依赖于小麦-黑麦( Seacle cereale L.)易位系T1BL·1RS所携带的 Pm8基因, 特别是在20世纪80—90年代选育的品种很多都含有 Pm8基因[ 4, 5, 6]。 Pm8基因的广泛利用导致对该基因的毒力菌株频率迅速上升, 使其抗性在全国各地迅速丧失。
与 Pm8不同的是, 有些抗白粉病基因即使应用多年, 对其具有毒性的菌株频率仍然保持较低水平, 例如 Pm2、 Pm4和 Pm6等基因[ 7, 8, 9]。 Pm2基因最早发现于前苏联的地方品种Ulka, 位于小麦5D染色体短臂(5DS)[ 10, 11]。 Pm2基因在我国的小麦品种中也有较多应用[ 8, 11, 12, 13, 14]。虽然在一些地区已经发现对 Pm2基因毒性频率较高的白粉菌菌株[ 15, 16, 17, 18], 但在很多冬麦和春麦区, 对 Pm2具有毒性的菌株频率仍然较低[ 7, 9, 19, 20]。因此, Pm2基因在我国仍具有利用价值。
汶农14是最近通过山东省和国家品种审定委员会审定的一个小麦品种[ 21, 22]。汶农14不但成株期高抗白粉病, 而且还具有很强的苗期抗性。遗传分析表明, 汶农14苗期对白粉病的抗性受1对显性基因控制, 利用与 Pm2紧密连锁的分子标记 Xcfd81检测, 汶农14与鉴别寄主Ulka/8*Cc ( Pm2)的扩增片段大小相同。因此, 汶农14的白粉病抗性可能与 P m2有关[ 23]。本研究的目的是利用分子标记分析方法, 定位汶农14的白粉病抗性基因, 以便更有效地用于抗病新品种的培育。
汶农14由山东省泰安市汶农种业有限责任公司育成, 系谱为84139//9215/876161, 2010年通过山东省品种审定委员会审定(编号鲁农审2010068)[ 21], 2011年通过国家品种审定委员会审定(编号国审麦2011015)[ 22]。抗性鉴定和抗谱比较, 以中作9504为感病对照; Ulka/8*Cc和Tabasco分别作为 Pm2和 Pm46的载体品种[ 17, 24]。
52个白粉病菌株主要采自黄淮冬麦区山东、河北、河南省, 以及邻近的湖北和江苏省(表1和表2)。采用苗期活体鉴定法或离体叶段鉴定法[ 25, 26]检测每个基因型的单株反应型, 两种方法各鉴定26个菌株。活体鉴定法是将种子播种于50孔(5 cm×5 cm)育种盘中, 待植株第一片叶完全展开时, 采用抖拂法将E09菌株新生孢子抖散在待测植株上, 保湿 24 h, 然后将育种盘移至18~22℃温室中生长; 接种后 15 d, 待感病对照充分发病时, 记录第一片叶的反应型。离体叶段鉴定法, 截取3 cm左右小麦叶段, 置于铺有滤纸的塑料方盒中, 用50 mg L-1苯骈咪唑(benzimidazole)保持滤纸湿润, 将新生的白粉菌分生孢子抖落在小麦叶段上; 接种后在18~22℃下培养7~10 d, 观察叶段的反应型。反应型调查采用0~4级标准[ 27], 其中0~2级为抗病反应型(R), 3~4级为感病反应型(S)。
在中国农业科学院作物科学研究所昌平试验站, 按李洪杰等[ 6]报道的方法鉴定成株期抗性, 灌浆期采用0~9级标准调查病害的严重度[ 28]。菌株的毒力型为 V1、 V3a、 V3b、 V3c、 V3d、 V3e、 V3f、 V4a、 V4b、 V5、 V6、 V7、 V8、 V17、 V19、 V25和 V35(周益林, 私人通讯)。
以汶农14为母本, 感白粉病品种邯4564为父本, 配制杂交组合用于抗病性遗传分析和抗病基因定位。杂种F1代自交获得F2分离群体, 进而通过自交获得相应的F2:3家系。将汶农14×邯4564杂种F1、F2和F2:3群体的种子分别播于50孔(5 cm × 5 cm)育种盘中, 幼苗一叶一心期用E09菌株接种, 接种的幼苗生长在18~22℃温室中, 15 d后按照0~4级标准[ 28]记载每个植株的反应型。根据不同世代的分离比例, 分析汶农14对白粉菌E09抗性的遗传规律。采用χ2测验对F2代和F2:3家系抗感分离比例进行适合性分析。
采用CTAB法提取小麦叶片基因组DNA。分别选取10个纯合抗病和感病F2代单株的DNA等量混合, 构成抗池(Br)和感池(Bs), 用于集群分离分析(BSA), 筛选和鉴定可能与抗病基因连锁的分子标记。所用的引物序列信息取自GrainGene 2.0网站(http://wheat.pw.usda.gov/GG2/index.shtml)。另外, 5DS染色体上开发的与抗白粉病基因连锁分子标记也被用于分析汶农14的抗病基因[ 13, 29, 30, 31, 32]。PCR反应在ABI 9700型GeneAmp扩增仪上进行。DNA扩增程序为, 94℃预变性4 min; 94℃变性30 s, 50~62℃退火40 s (根据引物设置), 72℃延伸1 min, 38个循环; 最后 72℃延伸10 min。PCR产物经19∶1、29∶1或39∶1的8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离, AgNO3染色后观察带型。
用Mapmaker/Exp Version 3.0分析SSR带型数据与白粉病抗性鉴定数据, 对汶农14的抗白粉病基因进行连锁性分析[ 33]。用Kosambi功能计算遗传距离(LOD≥3.0), 最大连锁距离设为50.0 cM[ 34]。
苗期活体鉴定结果显示, 汶农14对26个菌株中23个表现0、0;或1反应型, 即抗病反应型, 仅对E11、Bg37和Bg38表现感病。鉴别寄主Ulka/8*Cc ( Pm2)对Bg37、Bg56、Bg57和E18表现感病, 汶农14和Ulka/8*Cc相比, 对E11、E18、Bg38、Bg56和Bg57这5个菌株反应型不同, 汶农14抗Bg56、Bg57和E18, 但对E11和Bg38表现感病; 而Ulka/8*Cc ( Pm2)则相反; 邯4564对所有菌株都表现感病(表1)。
采用离体叶段法比较鉴定了4个材料对另26个菌株的反应。汶农14对20个菌株表现抗病反应型, 其中对Bg44-4、Bg77-2、Bg79-2、Bg79-3、Bg83-2和Bg84-3共6个菌株的反应型与Ulka/8*Cc ( Pm2)
不同, 对Bg79-2、Bg79-3和Bg83-2共3个菌株的反应型与Tabasco ( Pm46)存在差异; 除这些菌株外, 3个材料的反应型相同(表2)。对照品种中作9504对所有供试菌株都表现感病。
在灌浆期, 汶农14高抗接种的白粉菌混合菌株, 反应型为1级; 邯4564表现高感, 反应型为7级。这一结果证实汶农14对白粉病的成株期抗性。
用白粉菌菌株E09接种, 汶农14的反应型为0, 邯4564的反应型为3。10株汶农14×邯4564杂种F1植株的反应型均与汶农14相似。在鉴定的290株F2代植株中, 抗病和感病符合3∶1的分离比例, F2:3家系中纯合抗病、分离和纯合感病单株的比例符合1∶2∶1的理论值(表3)。这表明汶农14对E09菌株的抗性受1对显性基因控制, 将该基因暂命名为 PmW14。
前期的研究表明, Pm2连锁SSR标记 Xcfd81在汶农14中可扩增出与Ulka/8*Cc相似大小的片段[ 23]。该标记在亲本及汶农14×邯4564 F2分离群体构建的抗、感池之间表现多态病。按照 Xcfd81带型将F2群体分为纯合抗病、杂合和纯合感病植株, 其比例符合1∶2∶1, Xcfd8检测结果与 Xcfd81类似, 两者均为共显性标记。而 SCAR203的带型呈3∶1分离, 为显性标记。χ2检验带型分离的观察值符合理论值, 表明这些标记与汶农14的抗白粉病基因 PmW14连锁(表4)。用MapMarker 3.0进行两点测验分析, Xcfd8、 Xcfd81和 SCAR203与 PmW1 4的遗传距离分别为7.5、1.8和7.7 cM (表4), 其排列顺序为 Xcfd8- PmW14-Xcfd81-SCAR203。由于这些标记已经被定位于小麦缺失系5DS-1-0-0.63[ 29, 31], 因此, PmW14亦应位于该染色体区间。
根据不同群体定位结果, Pm2基因的连锁标记还有 Xcfd26、 Xcfd7、 Xcfd102、 Xcfd189、 Xgwm190、 Xcfd159、 Xcfd78和 Xbarc44[ 29, 30, 31]。在这些标记中, Xcfd189、 Xgwm190和 Xgwm159在汶农14与邯4564之间表现多态性, 但在抗、感池DNA之间没有多态性; 其他标记在亲本和抗、感池DNA之间均无多态性。为了获得更多 PmW14的连锁分子标记, 我们分析了188个小麦5DS染色体上的EST-SSR标记, 但在汶农14与邯4564以及抗、感池DNA之间均没有检测到多态性。在检测的5DS上99个SSR标记中, 9个在亲本间具多态性, 但在抗、感池DNA之间没有多态性, 因此未用于汶农14抗病基因作图(结果未列出)。
在小麦5DS染色体上定位的抗白粉病基因还有 PmD57-5D[ 32]和 Pm46[ 13]。与 PmD57-5D基因连锁的STS标记 Xbcd1871和 Xmag6176, 以及与 Pm46基因连锁的分子标记 Xgpw302、 Xcfd67、 Xwmc608、 Xmp510和 Xgwm205在汶农14与邯4564亲本之间没有多态性, 因而这些标记也未用于作图(结果未列出)。
汶农14是一个半冬性品种, 曾于2008年创造了11.4×103 kg hm-2的山东省小麦高产记录[ 22]。汶农14分别通过了山东省和国家小麦品种审定, 可在山东、河北中南部、山西南部、河南北部等地区推广种植[ 21, 22]。根据全国农业技术推广中心的资料(http://www. natesc.gov.cn/sites/cb/), 这些汶农14适宜推广的地区长期以来一直是白粉病的重发区。本研究结果显示, 无论在苗期还是在成株期, 汶农14对白粉病都表现很好的抗性, 这有助于通过寄主抗性减轻白粉病造成的经济损失, 同时降低化学药剂防治白粉病所产生的生产成本和防止施药所引起的环境问题。
鉴于汶农14具有良好的白粉病抗性, 并且农艺性状优良, 适应性广, 对汶农14的抗白粉基因进行分子定位, 发现其抗病基因连锁的分子标记, 不仅有利于抗病基因在小麦生产上的合理布局, 而且有助于通过分子标记辅助选择, 使其成为抗白粉病育种的一个有效亲本。根据汶农14×京双16的F2分离群体遗传分析结果, 汶农14对E09、E20和Bg2菌株的抗性均受1对显性基因控制[ 23]。本研究采用汶农14×邯4564分离群体也证明汶农14对E09菌株的抗性受1对显性基因控制。这表明汶农14对白粉病的抗性属质量性状, 因此, 建立与其抗病基因连锁的分子标记, 可促进该基因的利用。
通过分子标记分析, 汶农14的抗白粉病基因 PmW14被定位于小麦5DS染色体5DS-1-0-0.63区间, 介于 SCAR203和 Xcfd81标记之间。由于这2个标记与 Pm2紧密连锁, 因此 PmW14可能与 Pm2处于同一基因座上。我们检测了与 Pm2相关的11个分子标记与 PmW14的连锁关系[ 29, 30]。除了 Xcfd81和 Xcfd8与 PmW14连锁之外, 其他分子标记在汶农14×邯4564作图群体中均没有多态性。位于5DS染色体上的其他抗白粉病基因 Pm57D-5D[ 32]、 MlBrock[ 31]和 Pm46[ 13]的10个连锁标记中, 除 SCAR203外, 均不表现多态性。这些标记在不同作图群体上的多态性差异, 可能是群体的遗传背景不同所致。多菌株抗性鉴定结果表明, PmW14与 Pm2基因对鉴定的43个菌株的抗谱相似, 对9个菌株的反应型存在差异。因此, PmW14很可能与 Pm2基因相同, 亦或是 Pm2基因的一个等位基因。等位性测验可以进一步确定这两个基因是否是同一个基因。 PmW14与 Pm2基因对不同白粉菌菌株反应型的差异, 也可能是由于不同的遗传背景。除了汶农14之外, 我们还在良星66 [ 35]和中麦155 (未发表)检测到抗病基因 Pm2基因座的等位基因。
汶农14苗期和成株期对白粉病都表现良好的抗性。采用52个不同白粉菌菌株鉴定, 汶农14的抗谱与抗白粉病基因 Pm2相似。汶农14对E09菌株的抗性受1对显性基因( PmW14)控制。 PmW14被定位在5DS染色体的5DS-1-0-0.63区间, 与SSR标记 Xcfd8、 Xcfd81和 SCAR203紧密连锁, 很可能是 Pm2基因或其等位基因。
致谢: 中国农业科学院植物保护研究所周益林研究员提供部分白粉菌菌株, 江苏省农业科学院蔡士宾研究员提供Tabasco ( Pm46)种子, 谨致谢忱。
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