野生型拟南芥Col-0购自Arabidopsis Biological Resource Center。北京地区TuMV主要的流行强致病株系BJ-C4 (HQ446217)^{[ 12]}由中国农业科学院蔬菜花卉研究所提供。BJ-C4的cDNA克隆为本实验室前期构建并保存。大肠杆菌( Escherichia coli) DH5α菌株、农杆菌( Agrobacterium tumefacieus) GV3101:pMP90由本实验室保存。RNAi载体pHannibal^{[ 13]}由CSIRO的Peter Waterhouse博士惠赠。植物表达双元载体pBBBasta由地中海大学的Christophe Robaglia博士惠赠。

高保真酶Fast pfu DNA Polymerase、Easy Taq酶和分子量标记购自全式金公司。质粒小提试剂盒、胶回收试剂盒、PCR纯化试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司。M-MLV反转录酶、定量PCR试剂、限制性内切酶和Klenow Fragment购自TaKaRa公司。T4 DNA连接酶购自Promega公司。TRIzol提取液购自Invitrogen公司。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成, 由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

比对GenBank登录的122个TuMV株系序列, 根据TuMV不同株系间的保守性, 选取 HC-Pro基因的第841~1293位核苷酸序列共453 bp的保守片段为靶点, 构建RNAi载体。模板为BJ-C4的cDNA克隆。根据pHannibal载体上的酶切位点设计引物HC-Pro F和HC-Pro R (表1, 下画线部分为添加的酶切位点 EcoR I、 XbaI和 KpnI、 ClaI), 用高保真酶Fast pfu DNA Polymerase进行PCR扩增。扩增程序为94℃ 5 min; 94℃ 45 s, 52℃ 30 s, 72℃ 1 min, 35个循环; 72℃延伸7 min。PCR产物经琼脂糖电泳纯化后回收。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 研究中所用引物序列 Table 1 Primers used in this study 引物名称 Primer name 引物序列 Sequence of primer 引物用途 Usage of the primer HC-Pro F 5'-cggaattctctagaGTTAGCAAGTTACAGGGTGAC-3' 构建RNAi载体 Construct RNAi plasmid HC-Pro R 5'-ggggtaccatcgatGACGTGATATC CAGTTGACAGT-3' 构建RNAi载体 Construct RNAi plasmid CP F 5'-AAAGCGTAACCAAGACCGACCAT-3' 抗病性鉴定 Detect resistance to TuMV CP R 5'-TCCATCCAAGCCGAACAAAT-3' 抗病性鉴定 Detect resistance to TuMV SAND F 5'-AAGGCAGGAAATCACCAGGTTGTC-3' 内参引物 Reference gene SAND R 5'-TTAACGCATATGGAAGGGGAAGAC-3' 内参引物 Reference gene

表1 研究中所用引物序列 Table 1 Primers used in this study

用 ClaI和 XbaI分别酶切pHannibal载体和 HC-Pro目的基因片段, 经纯化回收后4℃连接过夜。连接产物经热击转化大肠杆菌。挑取克隆, 提取质粒并用 XbaI和 EcoR I酶切验证, 获得含反向片段的中间载体pHannibal+HC-Pro(-)。

用 KpnI和 EcoR I分别酶切 HC-Pro目的基因片段和连入反向片段的pHannibal+HC-Pro(-)中间载体。酶切产物经纯化回收后4℃连接过夜。连接产物转化大肠杆菌, 挑取克隆, 提取质粒并用 XbaI和 EcoR I双酶切验证, 获得同时含反向和正向片段的中间载体pHannibal+HC-Pro- RNAi。

pHannibal的发卡结构两端各含有1个 NotI酶切位点。把含发卡结构的中间载体pHannibal-HC-Pro-RNAi用 NotI酶切, 再用Klenow和dGTP在酶切片段的黏性末端补2个碱基G, 产物以1%琼脂糖凝胶电泳纯化, 回收含发卡结构的 NotI目的片段备用。

用 XmaI酶切植物表达双元载体pBBBast, 再用Klenow在黏性末端补2个碱基C, 产物经1%琼脂糖凝胶电泳, 回收载体片段, 再与含发卡结构的RNAi片段连接。所得质粒用 MluI酶切验证, 获得植物表达RNAi质粒pBBBTu-HC-Pro (图1)。

图1

Fig. 1

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	图1 载体pBBBTu-HC-Pro的T-DNA区段结构示意图Fig. 1 Sketch of the T-DNA region of pBBBTu-HC-Pro vector

利用电击法将pBBBTu-HC-Pro载体转入农杆菌GV3101:pMP90, 采用农杆菌介导的花序浸渍法侵染拟南芥^{[ 14]}。将收获的拟南芥T₀代种子播于盛有营养土的培养托盘中, 置22℃(昼)/18℃(夜)及光照周期为16 h (光)/8 h (暗)的人工气候室。待幼苗长出两片子叶后喷洒浓度为0.1%~0.2%的商业Basta除草剂筛选阳性苗。

经喷洒2~3次Basta除草剂筛选后, 从能够继续生长且长势良好的植株用小量快速法^{[ 15]}提取植物基因组DNA。用引物HC-Pro F和HC-Pro R进行PCR扩增检测。反应条件为94℃ 5 min; 94℃ 45 s, 52℃ 30 s, 72℃ 30 s, 35个循环; 72℃ 7 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测, 扩增出目的基因片段的为转基因阳性苗。

转基因T₁代苗自交留种, 对T₂幼苗喷洒0.1%~0.2% Basta除草剂后统计存活率。存活/死亡比约为3∶1, 初步确定为单拷贝植株, 并单株自交留种。继续筛选后代至不分离株系即为纯合株系。

将T₃代单拷贝纯合株系播种, 待幼苗长至8~10片莲座叶时期摩擦接种TuMV的BJ-C4株系。接种液按病叶鲜重／磷酸缓冲液体积(pH 7.0)约1 g 10 mL^-1比例配制。每个株系接种12~16株, 每株接种2片较大叶片。以非转基因野生型拟南芥Col-0作为对照接种。接种2 min后立即用清水冲洗叶片。在人工气候室中网罩隔离观察, 约20 d后进行抗病鉴定及病情指数统计。病情等级划分为0级(完全无症状); 1级(1~2片未接种叶花叶或发黄, 能抽薹); 3级(3~4片未接种叶花叶或发黄, 能抽薹); 5级(5~6片未接种叶花叶或发黄, 影响抽薹); 7级(多数叶片花叶或发黄, 不能抽薹); 9级(大部分叶片枯死, 植株濒临死亡)。

接种后约20 d, 选取各株系未接种叶片分别提取总RNA, 用M-MLV反转成cDNA。分别以TuMV- CP的196 bp片段为检测对象, 以拟南芥 SAND基因(AT2G28390)的298 bp片段为内参进行半定量和荧光定量分析。 SAND上游引物跨过内含子(表1, 一条下画线是外显子a, 2条下画线是外显子b), 以避免因基因组DNA污染所造成的影响。反应程序为94℃ 5 min; 94℃ 30 s, 57℃ 30 s, 72℃ 30 s, 30个循环; 72℃ 7 min。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。荧光定量PCR的反应以稀释40倍的cDNA为模板, SYBR-green I作荧光指示剂, 反应程序采用两步法扩增。扩增条件为95℃ 30 s; 95℃ 5 s, 57℃ 30 s, 72℃ 30 s, 40个循环。每个株系样品3次重复, 取平均值。

利用引物HC-Pro F和HC-Pro R以TuMV BJ-C4株系的cDNA克隆为模板, PCR扩增481 bp的目的带。纯化的PCR产物经双酶切后按先反向后正向的顺序插入pHannibal载体。

用 XbaI和 EcoR I分别双酶切pHannibal+HC-Pro- RNAi、连入反向片段的pHannibal+HC-Pro(-)和pHannibal空载体验证。将pHannibal+HC-Pro-RNAi载体酶切成5001、1723和6 bp, 连入反向片段的pHannibal+HC-Pro(-)载体切成5001 bp和1264 bp, pHannibal空载体切成5001 bp和823 bp。酶切结果显示质粒构建正确(图2)。

图2

Fig. 2

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	图2 双酶切验证pHannibal+HC-Pro-RNAi载体M: 1 kb plus分子量标记; 1: pHannibal+HC-Pro-RNAi; 2: 连入反向片段的pHannibal+HC-Pro(-); 3: pHannibal空载体。Fig. 2 Results of pHannibal+HC-Pro-RNAi by double digestionM: 1 kb plus marker; 1: pHannibal+HC-Pro-RNAi; 2: pHannibal+HC-Pro(-); 3: pHannibal vector.

用 NotI酶切pHannibal+HC-Pro-RNAi中间载体, 获得含正反向片段的RNAi发卡结构片段。将该片段插入植物表达双元载体pBBBast, 获得植物表达RNAi载体pBBBTu-HC-Pro。

植物表达载体pBBBTu-HC-Pro进行 MluI酶切检测。pBBBast载体本身有一个 MluI酶切位点, 连接的目的RNAi片段的CaMV启动子上另有一个 MluI酶切位点, 酶切后显示2条带的为阳性克隆。因是单酶切位点插入, 根据酶切条带大小可判断插入是与标记基因同向连接或反向连接(图1)。同向连接酶切条带为542 bp和9889 bp, 反向连接条带为3935 bp和6494 bp。结果显示RNAi结构已经连入植物表达载体, 并且为反向连接(图3)。

播种转化的拟南芥T₀代种子。幼苗经喷洒2~3次Basta除草剂后非转基因苗不能继续生长, 逐渐枯黄死亡; 转基因苗叶片保持绿色, 长势茁壮。共获得60株除草剂抗性植株。提取T₁代转基因苗的叶片基因组DNA进行PCR验证, 共有26株为PCR阳性苗。部分幼苗的PCR鉴定结果见图4。阳性苗自交留种, 后代经除草剂鉴定有约13个株系符合3∶1分离比, 初步认定为单拷贝插入株系。T₂代继续分株自交留种, 后代经除草剂鉴定, 获得纯合株系。

将T₃代13个单拷贝的纯合株系与野生型Col-0同时进行抗病接种鉴定。接种后20 d左右, 对照野生型Col-0

图3

Fig. 3

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	图3 pBBBTu-HC-Pro Mlu I酶切结果M: 1 kb plus分子量标记; 1: pBBBTu-HC-Pro。Fig. 3 Digestion results of pBBBTu-HC-Pro by MluI restriction enzymeM: 1 kb plus marker; 1: pBBBTu-HC-Pro.

图4

Fig. 4

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	图4 转基因植株的PCR鉴定M: 100 bp分子量标记; 1: 阴性对照; 2~8: 不同的转基因阳性植株。Fig. 4 Identification of the transgenic plants by PCRM: 100 bp marker; 1: negative control; 2-8: individual transgenic plants.

已基本枯萎死亡, 而转基因株系表现出不同的抗性, 其中4个株系(12号、14号、50号和59号)表现出较好的长势。高抗株系除部分叶片发黄外, 整株生长健壮, 且能正常抽 结实, 表现出对TuMV BJ-C4的高度抗性。经SPSS软件统计分析显示病情指数差异极显著(图5-B, 其中 P≤0.01); 高抗株系的抗病性比对照提高约80%以上。图5为高抗株系接种BJ-C4后的图片及病情指数统计结果。高抗转基因株系留种, 后代继续进行抗病鉴定。结果显示这些转基因株系对TuMV的高抗性可以稳定遗传。

用接种后非接种叶提取的RNA反转录成cDNA。以 SAND基因为内参, 用引物CP F/R扩增TuMV- CP基因的196 bp保守区段, 通过相对半定量及荧光定量PCR检测病毒的累积量。半定量结果如图6 所示, 在内参基因表达量差不多一致的情况下, 对照Col-0植株体内能检测到大量的病毒累积, 而在高抗转基因株系体内只能检测到微量的病毒。

荧光定量PCR的结果(图7)与半定量的结果相同。在对照Col-0体内检测到大量的病毒, 而4个高抗株系内几乎检测不到病毒的复制。说明构建的RNAi载体在抗病毒中发挥了作用, 转基因植株的抗病性显著提高。