供试小麦品种为西农1376, 由西北农林科技大学作物杂种优势研究与利用重点实验室提供。2010—2012连续3年的10月, 将西农1376种植于西北农林科技大学试验农场, 小区面积2 m × 1 m = 2 m², 4行区, 行距25 cm, 管理同大田。

11种供试药剂(由西北农林科技大学作物杂种优势研究与利用重点实验室及杨凌秦丰农业公司提供)配制成15种处理剂型, 其代码为T1~T15, 其中T12为T5和T6的1∶1混合物, T13为T6和T7的1∶1混合物, T14为T7和T8的1∶1混合物, T15为T8和T9的1∶1混合物。

4月初, 依据使用已有化学杂交剂SQ-1杀雄敏感发育期喷施杀雄的经验, 待西农1376发育到Feekes 7.5 (S1)、8.5 (S2, 旗叶伸出倒二叶鞘的一半)和9.5 (S3)时, 喷施不同剂量的化学杂交剂。2011年4月使用7种浓度, 但0.048、0.0096和0.0048 kg hm^-2 3个浓度处理后几乎不能诱导雄性不育, 因此以后2年试验只用4种浓度, 分别是4.8 (C1)、0.48 (C2)、0.24 (C3)和0.096 kg hm^-2 (C4); 以喷施清水为对照。

取即将散粉的小麦(整)穗10个, 放入冰盒, 快速带回实验室, 分别用1% KI-I₂和1.5%醋酸洋红对花粉粒染色, 观察淀粉粒的积累, 镜检花粉粒活性。取样时形态指标以对照(未用CHA处理)作为参照^{[ 9]}。

待小麦抽穗后未散粉前, 于各小区内分别对20株的主茎穗套袋, 成熟后统计结实率, 计算不育率。平均不育率 = (1-处理套袋穗平均结实粒数/未处理套袋穗平均结实粒数)×100%^{[ 10]}。药剂诱导后, 调查上述20个套袋的穗型和穗长, 并测定该套袋株的株高。

取药剂诱导不育性彻底植株的三核期穗, 用体视显微镜观察雌蕊活性, 并对不育性彻底的5株小麦进行饱和授粉, 分析植株饱和授粉结实率, 最终鉴定药剂处理条件下的雌蕊活力。平均授粉结实率 = (平均授粉小花结实数/平均授粉小花数) × 100%。

采用DPS统计软件, 对15种药剂在4种浓度条件下不育率3年重复数据先进行反正弦转换, 然后进行差异显著性分析。

各时期材料经FAA固定液固定1~3 d后, 转入70%酒精4℃保存。采用常规石蜡制片技术, 切片厚度12 μm, 番红-固绿染色, 于光学显微镜(Nikon ECLIPSE E600)下观察、采集图像^{[ 11]}。

经KI-I₂染色, 未用药剂处理的对照花粉粒呈深蓝色(图1-b), 而T8-C2 (图1-a)和T6-C3 (图1-c)处理的花粉粒呈浅黄色, 同时T6-C3处理的花药花粉量极少或无花粉, 其余药剂处理的花粉粒呈现深蓝或表现雌雄均不育。通过比较图1-a、b、c可知, Feekes 8.5时, T8-C2和T6-C3处理均可诱导植株完全雄性不育, 其花粉粒均呈浅黄色, 表现为败育, 而正常花粉粒呈蓝黑色, 具有活性。T6-C3处理, 在即将散粉时花药形态表现为干瘪、失水, 与正常花药相比出现早衰(图2-a), 而对照植株花药表现为饱满, 体积较大, 含水量高, 色泽鲜, 花粉丰富(图2-b)。用1.5%醋酸洋红分别对西农1376未药剂处理以及 T8-C2和T6-C3处理的植株花粉粒染色, 镜检发现对照的花粉粒形状规则, 圆形, 精核发育呈鱼状, 表现为正常可育(图1-e); 而T8-C2和T6-C3处理的花粉粒形状不规则、畸形、部分细胞破裂, 核几乎成透明解体状, 整个花粉粒呈多边结晶状, 明显败育(图1-d和图1-f)。三核散粉期, 田间形态调查表明, T8-C2诱导的不育群体穗部颖壳张开度较低, 几乎呈闭颖状态, 很难接受外来花粉, 而T6-C3 (图2-a)诱导的不育群体穗部颖壳张开度增大, 呈蓬松状, 易于接受外来花粉。在小麦灌浆后期, 田间剥去小麦颖壳看到, T6-C3 (图2-c)处理为空壳而对照(图2-c)结实饱满。说明T6完全可以在合适的药剂浓度和适宜植株发育时期彻底诱导小麦西农1376花粉粒完全败育, 且雌蕊发育正常。

图1

Fig. 1

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	图1 1% KI-I2和1.5%醋酸洋红染色后成熟花粉粒镜检结果a~c: KI-I2染色; d~f: 醋酸洋红染色。a和d: T8-C2; b和e: 对照; c和f: T6-C3。Bar= 40 μm。Fig. 1 Mature pollen stained with 1% KI-I2 and 1.5% aceto carminea-c: stained with KI-I2; d-f: stained with aceto carmine. a and d: T8-C2; b and e: CK, without agent treatment; c and f: T6-C3. Bar = 40 μm.

图2

Fig. 2

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图2 T6-C3诱导的雄性不育穗与对照的形态学比较a: 去掉外稃的T6-C3处理小穗; b: 去掉外稃的对照小穗; c: 对照和T6-C3处理灌浆后期小穗比较。Pi: 柱头; An: 花药; Se: 种子; NS: 不结实。Fig. 2 Morphological comparison between the male sterile spike induced by T6-C3 and the normal fertile spikea: T6-C3 spikelet with lemma removed; b: CK spikelet with lemma removed; c: comparison of spike between CK and T6-C3 at anaphase of filling stage. Pi: pistil; An: anther; Se: seed; NS: no seed.

待西农1376发育到Feekes 7.5、Feekes 8.5和Feekes 9.5时, 分别喷施不同浓度的化学药剂, 抽穗期以后调查植株表型。Feekes 8.5时期, 雄蕊对同种药物同浓度处理最敏感; Feekes 7.5时期, 个别浓度的药剂诱导小麦抽穗困难, 出现“卡脖”现象, 普遍表现植株矮化、发育困难; Feekes 9.5时期, 小麦的耐药性增强, 个别药剂特定浓度下可诱导不育, 但败育不彻底。可能不同发育时期的小麦对杂交剂敏感程度不同, 有待深入研究。本试验最终确定的最佳喷施时期为Feekes 8.5。

对Feekes 8.5各处理植株的外部形态和育性调查列于表1。可见, 药剂浓度对穗长、株高等有很大影响, C1和C2高浓度条件下, 部分处理穗短小, 株型矮化, 甚至夭折。随施药浓度的降低, T6、T8、T12、T14和T15在C2浓度条件下完全可诱导植株雄性不育, 但T12、T14和T15 处理在诱导不育的同时也会诱发穗畸形, 植株发育延缓, 抽穗困难等现象, 表明这几种化学药剂在相应浓度条件下诱导雄性不育效果较差。T8-C2处理虽表现花粉败育, 但植株矮化, 颖壳开张度小, 不易接受外来花粉, 可能与喷药时小麦发育时期与处理药物种类、浓度的互作相关。T6-C3处理抽穗正常, 株高、穗型等不受影响, 且能获得不育群体(图2-c), 同时不育穗颖壳呈蓬松状, 开张度较大, 易于接受外来花粉, 天然异交率高。另外还发现, 多数药剂处理的植株均能正常生长, 穗型、抽穗及育性等不受影响, 但T6-C3和T6-C4处理(浓度分别为0.24 kg hm^-2和0.0096 kg hm^-2)除外。

表1

Table 1

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	表1 植株外部形态特征及育性Table 1 External form and feritility of plant tested

综上分析, 西农1376植株在4.80 kg hm^-2浓度药剂处理下会产生药害, 导致死亡或不抽穗; 0.48 kg hm^-2浓度时T12、T14和T15药剂严重影响抽穗, 导致穗畸形, 即使该浓度药剂处理条件下小麦败育, 也不宜应用于生产; 0.24 kg hm^-2浓度条件下部分药剂可诱导植株雄性不育(如T6), 且不育率较高。T6与T8相比, 小麦穗型受影响小, 且不育性相对彻底。

T1、T2、T3、T4、T5、T9、T10和T11药剂在较小剂量条件下, 处理株型及花粉育性均表现正常, 与对照差

异不显著; 但高药剂浓度处理出现整株致死现象。T7在不同浓度下均出现抽穗困难, 长期保持营养生长, 不进入生殖生长, 不拔节与抽穗; 4.80 kg hm^-2浓度下, T6、T8、T12、T13、T14和T15处理后西农1376植株均显现药害, 抽穗率低、植株畸形或死亡。T6和T8对西农1376诱导不育的有效浓度为0.24~0.48 kg hm^-2, 以0.24 kg hm^-2杀雄效果最佳, 不育率达93.33%以上, 部分单穗不育率达100%, 且抽穗及穗型不受影响。0.48 kg hm^-2浓度的T12、T13、T14和T15均可诱导100%不育, 与对照有极显著差异, 但株型所受影响较大, 表现为严重矮化、穗短, 影响植株正常生长发育。在0.24 kg hm^-2和0.096 kg hm^-2的低浓度条件下, T12、T13、T14和T15诱导不育率低, 结实率较高, 但有少数单穗的不育率高。

理想的化学杂交剂除了能诱导彻底的雄性不育外, 还要有较高的人工饱和授粉结实率, 才能说明其诱导后雌蕊发育正常。观察T6-C3处理植株雌蕊, 发现散粉期柱头发育基本正常(除药剂喷施不匀而引起的雌蕊死亡), 但与对照植株雌蕊相比, 柱头短小, 子房膨大(图3-a)。对T6-C3诱导杀雄后的植株进行饱和授粉, 能获得杂交种子(图3-b), 结实率为83.33%。

图3

Fig. 3

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	图3 T6-C3诱导不育系的雌蕊及其饱和授粉后所结杂交种a: T6-C3诱导(Tr)和对照(CK)的雌蕊; b: T6-C3处理植株饱和授粉后所结种子。Fig. 3 Pistils of the male sterile plants induced by T6-C3 and its hybrid seeds after saturated pollinationa: pistils of T6-C3 (Tr) and CK (CK); b: hybrid seeds produced in T6-C3 induced plants after saturated pollination.

不同的发育时期, 对照和化学药剂处理后不育花药的绒毡层降解速率存在明显的差异^{[ 12, 13]}。四分体时期(图4-a), 绒毡层细胞体积相对其他发育时期明显较大, 近长方形, 细胞质浓厚, 染色较深; 不育花药绒毡层细胞质浓度较低, 染色较浅, 呈不规则状(图4-f)。单核早期, 正常花药小孢子自四分体胼胝质壁中释放后, 体积逐渐增大, 并进一步形成花粉内、外壁和一个萌发孔, 此时, 绒毡层细胞开始转向退化, 正对萌发孔的位置退化严重, 开始呈现不规则的形状(图4-b)。不育花药较对照绒毡层细胞核开始明显降解, 但花粉粒外形发育基本正常(图4-g); 单核后期, 正常花药细胞质液泡化程度增强, 逐渐形成中央大液泡而将细胞核推向一侧, 到花粉粒单核靠边期, 绒毡层退化程度进一步加剧, 可以看到部分未退化完全的绒毡层(图4-c)。不育花药绒毡层细胞质及核基本退化完全, 但仍有残余绒毡层细胞壁, 同时花粉粒核也基本开始退化并伴随着花粉畸形发育(图4-h); 发育至二核期和三核期, 正常花药(图4-d, e)绒毡层退化完全, 仅留表皮和一层细胞壁带状不均匀加厚的药室内壁(纤维层), 但花粉粒发育正常, 精核呈鱼状。不育花药(图4-i, j)除绒毡层完全退化外, 花粉粒(二核期)基本完全破裂, 不具有规则的外形, 内容物持续降解至绒毡层(三核期)和花粉核完全降解, 仅剩花粉粒外壁。结果表明, 处理后不育花药的绒毡层较对照细胞内含物少, 且营养物质不足, 在小孢子发育过程中不能及时足量地提供营养, 导致花粉粒发生自溶败育。

图4

Fig. 4

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图4 正常可育及T6-C3处理诱导生理型不育花药切片a~e:可育花粉粒; f~j; 生理型不育花粉粒。a和f: 孢子四分体时期; b和g: 单核早中期; c和h: 单核中后期; d和i: 二核期; e和j: 三核期。 Ta: 绒毡层。Bar = 40 μm。Fig. 4 Transections of fertile and physiological male sterile anthers induced by T6-C3a-e: fertile pollens; f-j: physiological male sterile pollens. a, f: tetrad stage of microspore development; b, g: mononuclear pollen early-middle stage; c, h: mononuclear pollen middle-later stage; d, i: binuclear stage; e, j: trinuclear stage; Ta: tapetum; Bar = 40 μm.