选用亲本材料为青海大黄油菜(黄籽)和09A- 126 (褐籽), 由青海省农林科学院春油菜研究所提供。大黄油菜和09A-126均已连续自交或兄妹交8代以上, 粒色性状稳定。以09A-126为供体亲本, 大黄油菜为轮回亲本, 进行连续回交。在BC₁、BC₂和BC₃世代中均保留褐籽单株上收获的种子播种, 用于下一轮的回交, 获得的BC₄分离群体作为 Brsc1基因的定位群体; 大黄油菜和09A-126杂交获得的F₁单株自交, 获得F₂群体, F₂中每一个单株套袋自交, 获得F_2:3家系, 用于F₂单株基因型的鉴定。

在苗期, 从BC₄群体和F₂群体每株油菜中取适量叶片, 采用CTAB法提取总DNA, 参考Doyle^{[ 19]}的方法并略作改动。使用紫外分光光度计测定每个单株总DNA浓度, 稀释至50 ng µL^-1, 冷藏备用。

在角果完全成熟后, 采用目测法调查BC₄群体、F₂群体及F_2:3家系所有单株种皮颜色。根据粒色将BC₄群体所有单株DNA分为黄籽和褐籽两组; 根据F₂群体单株粒色性状和F_2:3家系中粒色性状是否分离将F₂群体单株DNA分为黄籽、纯合褐籽(不分离)和杂合褐籽(分离) 3组。

在BC₄群体中随机挑选12个黄籽单株和12个褐籽单株, 每6个单株DNA等量混合, 分别构建2个黄籽基因池和2个褐籽基因池。采用 Pst I/ Mse I的酶切组合, 首先利用256对选扩引物(P01~16/MG01~ 16)和4个基因池筛选标记, 用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增产物。能区分黄籽和褐籽基因池的多态性标记继续用BC₄分离群体单株检测, 最终筛选出与粒色性状紧密连锁的AFLP标记^{[ 20, 21]}。参照陆光远^{[ 22]}的方法操作。AFLP引物由上海生工生物工程有限公司合成。

在6%聚丙烯酰胺凝胶胶板干燥之前将AFLP特异片段用刀片轻轻挖出并转入0.5 mL离心管中, 加20~40 μL ddH₂O, 沸水浴10 min后取上清液利用原引物重新扩增, 用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物, 用Sanprep柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工生物工程有限公司)从琼脂糖胶块中回收目标片段。将目标片段与pMD18-T载体(大连宝生物工程有限公司)连接, 导入DH5α大肠杆菌感受态细胞克隆扩增, 经蓝白斑筛选和电泳检测, 从每个目标片段挑选3个阳性克隆菌液, 送上海生工测序。具体操作参照易斌^{[ 23]}的方法。

测序后, 在BRAD数据库(http://brassicadb.org/brad/index.php)和TAIR数据库(http://www.arabido-psis.org/)中, 使用Blast命令分析每个AFLP特异片段与白菜型油菜基因组和拟南芥基因组的序列共线性, 确定每个特异片段所在染色体及在染色体上的物理位置^{[ 24, 25, 26]}。

根据AFLP特异片段的序列信息, 利用Primer3软件(http://frodo.wi.mit.edu/)设计SCAR引物, 由上海生工生物工程有限公司合成。首先在基因池和BC₄分离群体部分单株中检测合成后的SCAR引物是否具有多态性, 然后在F₂群体中用黄籽、杂合褐籽和纯合褐籽的单株检测其是否为共显性标记。参照李霞^{[ 27]}的方法进行SCAR引物PCR。

根据Xiao等^{[ 18]}对目标基因的定位结果及本研究AFLP分析比对结果, 从BRAD数据库下载目标基因所在区域内的已公布的SSR标记, 并下载相关区段DNA序列, 用SSRHunter 1.3软件检测SSR位点, 用Primer3软件设计SSR引物。参照Cheng等^{[ 28]}的PCR体系, 检测方法与SCAR引物检测方法相同, 见1.5。

利用BC₄群体所有单株检测特异性AFLP和SSR标记, 筛选交换单株, 计算重组率, 用Kosambi函数将重组率转换为遗传距离^{[ 29]}。用MapMaker/Exp 3.0软件分析标记与目标基因之间的连锁关系, 构建目标基因所在染色体局部区域的遗传连锁图谱^{[ 30]}。连锁标记在染色体上的物理位置可由BRAD数据库获得。用MapDraw Ver. 2.1软件绘制遗传连锁图谱和连锁标记的物理图谱^{[ 31]}。

利用4个基因池检测AFLP引物, 若多态性片段同时出现在2个褐籽基因池中, 而在2个黄籽基因池中都缺失, 则认为可能与目标基因连锁。将这些引物组合挑出, 用于分析BC₄群体中随机挑选的6个黄籽单株和6个褐籽单株。部分标记, 尤其是在基因池检测中多态性条带较弱的标记, 在进行单株检测时多态性消失; 部分标记检测出的重组单株大于2株, 说明离目标基因较远, 同样予以舍弃。特异条带清晰且检测出的重组单株少于2株(包含2株)的AFLP标记, 被认为是与目标基因紧密连锁的AFLP标记。本研究中, 共筛选256对引物组合, 获得5个与目标基因紧密连锁的标记, 将其分别命名为Y11~Y15 (表1)。

5个AFLP特异片段经回收、克隆和测序, 序列信息提交BRAD数据库序列比对表明, 5个特异片段均与白菜型油菜A9染色体序列高度同源, 与Xiao等定位结果一致, 进一步证实控制粒色性状的基因位于A9染色体上; 5个AFLP特异片段的序列信息同时提交TAIR网站序列比对表明, Y11和Y15标记分别与拟南芥第5染色体和第2染色体部分序列同源(表1)。

根据5个AFLP特异片段的序列信息, 在靠近特异片段序列末端区域设计SCAR引物, 每个AFLP特异片段设计一对SCAR引物, 分别命名为SC11~ SC15, 其引物序列及退火温度见表2。5个SCAR标记经基因池和BC₄群体单株验证, 检测结果与对应AFLP标记一致, 表明5个AFLP标记均被成功转化为SCAR标记。5个SCAR标记在F₂群体部分单株中检测结果表明, SC14在黄籽、杂合褐籽和纯合褐籽单株中扩增出了不同的带型, 能够区分黄籽、杂合褐籽和纯合褐籽3种类型的单株, 为共显性标记。其余4个SCAR标记均为显性标记。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 与 Brsc1紧密连锁的AFLP标记 Table 1 AFLP markers closely linked to Brsc1 标记名称 Marker 引物序列 Primer 特异片段 Specific fragment (bp) 白菜型油菜连锁群 Linkage group of B. rapa (position) 白菜型油菜同源基因 Orthologous gene on B. rapa 遗传距离 Genetic distance (cM) 拟南芥连锁群 Linkage group of A. thaliana (position) 拟南芥同源基因 Orthologous gene on Arabidopsis Y11 P-GCA/M-GAG 144 A9 (13, 623, 148-13, 622, 882) Bra027520 — Chr5 (17, 709, 027-17, 709, 261) AT5G44010 Y12 P-GGT/M-GAA 120 A9 (16, 472, 257-16, 472, 371) — 0 — — Y13 P-TGT/M-GTG 267 A9 (9, 538, 042-9, 537, 755) — — — — Y14 P-TGC/M-GCG 132 A9 (14, 484, 822-14, 484, 254) — 2.8 — — Y15 P-ACT/M-GTT 160 A9 (14, 834, 923-14, 834, 749) Bra017382 2.5 Chr2 (1, 071, 113-1, 071, 178) AT2G03520 —: 无相应结果。 —: no relevant result. P: 5'-GACTGCGTACATGCAG-3'; M: 5'-GATGAGTCCTGAGTAA-3'.

表1 与 Brsc1紧密连锁的AFLP标记 Table 1 AFLP markers closely linked to Brsc1

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 由特异性AFLP标记转化所得SCAR标记 Table 2 SCAR markers developed from AFLP markers AFLP标记 AFLP marker SCAR标记 SCAR marker 上游引物 Forward primer (5'-3') 下游引物 Reverse primer (5'-3') Tm (℃) Y11 SC11 GGAACGCCAGAAGATTG TTCATCTCGCTCGAATCG 55 Y12 SC12 GAGAAGACGTCCATGACC GGTTGACACTATTCGCAG 55 Y13 SC13 CGAGAGTGCAGGAAGTGAAGC TTCGGACATAGTGCGCGAC 55 Y14 SC14 TGCGAGGATACAATAGCGAC AGGATCGTCTCGTTACGTGC 58 Y15 SC15 GCAGACTCTGTCCAAGTTAG GACGATCTCCGATACTCTCC 58

表2 由特异性AFLP标记转化所得SCAR标记 Table 2 SCAR markers developed from AFLP markers

从BRAD数据库中白菜型油菜A9染色体上目标基因所在区段下载得到已公布的SSR标记, 并在该区段每隔一段距离设计开发一个新的SSR标记。合成后的SSR引物在基因池和BC₄分离群体中进行多态性检测, 结果发现, 在已公布的SSR标记中, 共有3个标记(B089L03-3、BrID10607和KS10760)与目标基因连锁。图1所示为KS10760在BC₄群体部分单株中的扩增结果。新开发的SSR引物中, 有4个标记(A1~A4)表现为与目标基因连锁。以上获得的7个特异性SSR标记的引物序列及在染色体上的位置详见表3。利用F₂群体3种类型的单株(黄籽、杂合型褐籽和纯合型褐籽)对7个特异性SSR标记进行检测, 结果发现只有标记A1具有共显性, 其扩增结果如图2所示。

BC₄定位群体共包含1739个单株。获得的所有特异性标记的物理位置可由BRAD数据库获得, 首先在BC₄群体中随机挑选48个黄籽单株和48个褐籽单株, 对所有特异性标记进行初步检测, 根据交换单株的分布和数目及特异性标记在染色体上的位置, 选择位于目标基因两侧且扩增条带清晰、交换单株数目适中的B089L03-3和Y14标记对BC₄群体所有单株进行检测, 寻找交换单株, 然后利用B089L03-3和Y14之间的所有特异性标记对这些交换单株进行检测, 包括Xiao等所获得的4个AFLP标记(Y05~Y07, Y10)和本研究所获得的8个特异性标记(Y12、Y15、BrID10607、KS10760和A1~A4), 其中Xiao等所获得的标记在BC₄群体中仍具有明显多态性, 分别得到这些标记的交换单株, 确定重组率, 计算遗传距离, 如表1和表3所示, 构建遗传连锁图谱如图3-B所示, 并结合Xiao等定位结果, 绘制了整合后的物理图谱, 如图3-C所示。新构建的遗传连锁图谱中包含2个共分离标记Y05和Y12, 除Y12外, 各标记在连锁图中的分布与其在染色体上的物理位置基本一致, 据此将目标基因锁定于Y06 (19.3 Mb)和A4 (17.6 Mb)标记之间1.7 Mb的区间内。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 与 Brsc1紧密连锁的SSR标记 Table 3 SSR markers closely linked to Brsc1 SSR标记 SSR marker 引物序列 Primer sequence (5'-3') 白菜型油菜连锁群 Linkage group of B. rapa(position) 遗传距离 Genetic distance (cM) 白菜型油菜同源基因 Orthologous gene on B. rapa 拟南芥同源基因 Orthologous gene on Arab i dopsis BrID10607 F: GTGTGATAAAACTGAAACGG A9(21,304,313-21,304,407) 0.63 — — R: TGAGCAGAGCACACGTCTA KS10760 F: TAGCAGTGGCCTACTCCTTG A9(21,015,520-21,016,064) 0.57 Bra023174 AT1G31300 R: CAGCATTGTGATGTGTCAGG B089L03-3 F: TTGTTTTTAACTAATAGT A09(23,247,111-23,247,848) 3.80 Bra024734 AT1G25570 R: TGGTCGGGGAGCCATGTGCG A1 F: CCTCTGAACAAGATGTCG A9(21,964,641-21,964,497) 0.80 Bra032382 AT1G30360 R: CCAGATCAGAAGCAACG A2 F: TCGAGCAAGAAGCCAAGC A9(21,722,136-21,721,949) 0.75 Bra032409 AT1G30620 R: GCGTAATCCAGTCCTACATTCC A3 F: AGAGCTTGTAGGTGCAGATG A9(21,255,963-21,255,768) 0.63 — — R: GCCGTGAGACAGAGAGTATC A4 F: GGAGAATCTATCAACGCCTG A09(17,731,411-17,731,140) 0.98 — — R: TCGGTATCTTCGGAACAGAG —: 无相应结果。 —: no relevant result.

表3 与 Brsc1紧密连锁的SSR标记 Table 3 SSR markers closely linked to Brsc1

图1

Fig. 1

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	图1 引物KS10760在BC4群体单株中的扩增检测结果1~48: 黄籽单株; 49~96: 褐籽单株; M: DNA分子量标记。Fig. 1 Amplification results of KS10760 in individual plants of BC4 population1-48: yellow-seeded plant; 49-96: brown-seeded plant; M: 100 bp DNA ladder.

图2

Fig. 2

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	图2 引物A1在F2群体单株中的扩增检测结果1~8: 黄籽单株; 9~16: 杂合褐籽单株; 17~24: 纯合褐籽单株; M: DNA分子量标记。Fig. 2 Amplification results of A1 in individual plants of F2 population1-8: yellow-seeded plant; 9-16: heterozygous brown-seeded plant; 17-24: homozygous brown-seeded plant; M: 100 bp DNA ladder.

图3

Fig. 3

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	图3 Brsc1基因区域的遗传连锁图谱A: Xiao等[ 18]构建; B: 本课题组构建; C: A9染色体上与 Brsc1连锁的分子标记的物理图谱。虚线为同一标记在不同图谱中的位置。Fig. 3 Linkage map of Brsc1geneA: constructed by Xiao et al.[ 18]; B: constructed by our research group; C: map of markers linked with Brsc1 on A9 of B rassica rapaL. dotted lines indicate the same marker on different maps.