海岛棉Pima 90-53为抗黄萎病品种, 陆地棉冀棉20为耐病品种, 陆地棉邯208为感病品种, 均由河北农业大学棉花遗传育种研究室提供。强致病力黄萎病菌系VD-gfp77为绿色荧光蛋白标记的大丽轮枝菌, 由中国农业科学院戴小枫研究员惠赠。

按照Zhang等^{[ 12]}方法培养黄萎病菌, 将4℃冷藏保存的VD-gfp77转移至PDA平面培养基中, 于25℃培养箱培养7~10 d, 然后将菌落破碎成合适大小的菌块, 接种于Czapek’s培养液中, 25℃振荡(110转 min^-1)培养10 d, 用3层纱布过滤后, 调节滤液孢子浓度至每毫升1×10⁷个备用。

棉花种子经硫酸脱绒后于室温浸泡8 h, 25℃催芽24 h, 选择发芽整齐一致的种子播于装有蛭石的营养钵中, 在生长室内(昼温25~26℃, 夜温20~22℃)培养, 并定期浇Hoagland营养液。当棉苗长至第一片真叶展开时将孢子悬浮液从底部注入营养钵, 每钵接种15 mL, 对照接种等量的水。其后继续培养。

分别取接种黄萎病菌后0、4、8和24 h的棉苗, 利用激光共聚焦显微镜, 以488 nm光激发, 观察黄萎病菌侵染棉花根部组织的进程。

分别取黄萎病菌侵染0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、2 d、4 d、7 d、14 d、21 d、28 d和35 d的棉苗子叶基部下方1 cm处的茎段组织, 制作石蜡切片, 经番红-固绿染色后以Olympus BX51荧光显微镜蓝光激发, 观察黄萎病菌侵染的棉花茎部组织细胞结构变化。

以河北农业大学育种中心田间病圃种植的Pima 90-53、冀棉20和邯208为材料, 在黄萎病发病高峰期分别取各品种中部果枝(第5~第6果枝)基部的叶片和叶柄组织备用。按照Sluiter等^{[ 13]}中所述方法将冷冻干燥处理后的样品研磨成粉末, 准确称取3.00±0.01 g, 在索氏提取器中用乙醇抽提24 h, 风干后置具盖试管, 加72% H₂SO₄ 3 mL, 剧烈振荡 1 min混匀。30℃水浴60 min, 期间每5 min振荡一次。再加84 mL蒸馏水, 稀释H₂SO₄浓度至4%, 并混匀。此时反应体积为86.73 mL。121℃水解60 min后经滤纸过滤, 收集滤液用于酸可溶性木质素(acid soluble lignin, ASL)含量测定, 残渣用于酸不可溶性木质素(acid insoluble lignin, AIL)含量测定。

以4% H₂SO₄为对照, 使用320 nm检测滤液中酸可溶性木质素, 若吸收值超出0.7~1.0范围, 可适当稀释滤液。

酸可溶性木质素含量 ASL(%) = A_{320 nm}× 86.73 × n/(30 × W) × 100%, 式中 A_{320 nm}为滤液在320 nm处的吸收值, 86.73为反应液体积(mL), n为滤液稀释倍数, 30为百分吸光系数(L g^-1 cm^-1), W为样品干重(g), 比色杯的厚度为1 cm。

将坩埚在马弗炉内575℃±25℃干燥6 h以上, 冷却后称重, 至恒重后记录结果。以105℃烘干滤纸6 h以上, 恒重后记录为W1; 575℃±25℃焚烧24 h冷却后称至恒重W2, 滤纸灰分率为W2/W1。105℃烘单张滤纸6 h以上, 称至恒重后记录为W3。用不少于50 mL的蒸馏水冲洗残渣, 将滤膜和残渣共同放入坩埚内, 105℃±3℃干燥4 h, 冷却后称重为W4。575℃±25℃焚烧24 h冷却后称至恒重W5。

酸不可溶性木质素(AIL)=滤渣干重(W4)-灰分重(W5)-滤纸干重(W3)×滤纸灰分率(W2/W1)/样品干重×100%, 式中W单位为g。

使用TRIzol总RNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)分别提取Pima 90-53、冀棉20和邯208的接水对照及接菌处理后0、2、6、12、24、36、48和72 h的根部总RNA。取1 μg经DNaseI消化的总RNA, 反转录得到cDNA用于Real-time PCR分析。以棉花组成型表达基因 Ghactin作为内参, 使用LightCycler 1.5罗氏荧光定量PCR仪进行3次生物学重复Real-time检测。根据本实验室克隆的漆酶EST序列信息^{[ 14, 15]}设计合成Real-time引物Lacr-F: 5'-ATGGGTTTACAGCAAGG-3'和Lacr-R: 5'-GCA ATGTGGTTGTGTTG-3', 根据NCBI数据库提供的陆地棉GhActin 1~15的保守序列, 设计合成Ghactin的Real-time引物GhActin-F: 5'-TTCTCACGGAAGC ACCTCTC-3'和GhActin-R: 5'-ACGACCACTGGC ATACAAAG-3'。PCR程序为95℃, 10 s; 95℃ 10 s, 55℃ 10 s, 72℃ 15 s荧光检测, 35个循环; 72℃→94℃ 0.05℃ s^-1溶解曲线荧光检测。采用2^-ΔΔCT法^{[ 16]}分析基因相对表达量。

观察绿色荧光蛋白标记的黄萎病菌VD-gfp77 (图1)侵染的不同抗性棉花品种的根部组织, 结果显示, 在接菌4 h时, 不同抗性的棉花品种的根部组织均已被病原菌附着; 接菌24 h时, 在海岛棉抗病品种Pima 90-53的根部导管组织中没有发现病原菌的侵入, 仅在根部组织的表皮层有黄萎病菌VD-gfp77的附着, 而陆地棉耐病品种冀棉20和感病品种邯208的导管组织均有病原菌侵入(图2)。荧光显微观察结果说明海岛棉与陆地棉根部在抵御黄萎病菌进入时存在明显差异, 而陆地棉抗、感品种之间无差异。

图1

Fig. 1

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	图1 绿色荧光蛋白标记的黄萎病菌VD-gfp77荧光显微观察Fig. 1 Observation of fluorescence in Verticillium dahliae VD-gfp77 marked with gfp using Confocal

图2

Fig. 2

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	图2 黄萎病菌侵染不同棉花品种根部组织的显微观察Fig. 2 Observation of root tissue in cotton varieties infected with Verticillium dahliae using Confocal (×800)

观察病菌侵染后0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、2 d、4 d、7 d、14 d、21 d、28 d和35 d不同品种茎部组织石蜡切片的细胞结构, 发现接菌后随着棉花生长时间延长, 抗(耐)病品种的导管组织细胞壁木质化程度高, 导管堵塞轻; 而感病品种木质化程度低, 导管堵塞严重。接菌4 d时, 海岛棉抗病品种Pima 90-53茎部导管组织的细胞壁被番红着色后呈红色, 说明已普遍木质化且导管未发生堵塞现象, 而陆地棉耐病品种冀棉20导管的细胞壁无显著变化且导管亦未发生堵塞现象, 陆地棉感病品种邯208导管细胞壁亦无显著变化而导管内部发生轻度堵塞现象。接菌35 d时, Pima 90-53的茎部导管细胞壁均被番红特异染色呈红色, 而固绿不着色, 蓝光波长激发下木质素自发荧光较强, 说明细胞壁已高度木质化, 且导管堵塞不明显; 冀棉20导管细胞壁均被番红和固绿染色, 且着色较轻, 自发荧光强度居中, 说明细胞壁中度木质化, 且导管堵塞不明显; 而邯208根部组织细胞壁番红特异着色很少, 固绿染色较深, 自发荧光较弱, 说明细胞壁仅发生轻度木质化, 且导管堵塞严重(图3)。由此可见, 导管细胞壁的木质化程度与棉花抗性表现一致。

图3

Fig. 3

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	图3 黄萎病菌侵染不同抗性棉花品种茎部组织的显微观察Fig. 3 Observation of paraffin tissue section of different cotton varieties infected with Vertici l lium dahliae (×800)

相对于陆地棉感病品种邯208, 抗病海岛棉Pima 90-53的叶片和叶柄中的酸可溶性木质素含量分别降低17.1%和31.3%, 均差异显著; 陆地棉耐病品种冀棉20的同一组织中分别降低2.5%和6.2%, 差异分别为不显著和显著。而在抗病海岛棉Pima 90-53的同一组织中酸不可溶性木质素含量分别提高39.7%和36.6%, 均差异显著; 在陆地棉耐病品种冀棉20中分别提高18.7%和29.5%, 亦均差异显著(表1)。相关分析结果显示叶片中的细胞壁酸不可溶性木质素含量与Pima 90-53、冀棉20和邯208的病情指数(18.14、41.00和60.49)^{[ 17]}呈显著负相关( r= 0.99991^*), 即细胞壁酸不可溶性木质素含量与棉花黄萎病抗性呈显著正相关。此外, 通过对酸不可溶性木质素与酸可溶性木质素的比值分析发现, 其比值大小与棉花的抗性强弱亦表现一致。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 病圃中不同抗性棉花品种细胞壁木质素含量 Table 1 Content of lignin in three different cotton varieties in the disease nursery 成分 Component 组织 Organ 邯208 Han 208 冀棉20 Jimian 20 比马90-53 Pima 90-53 酸可溶性木质素 Acid soluble lignin (ASL) 叶片Leaf 1.58±0.02 A 1.54±0.02 A 1.31±0.01 B 叶柄Petiole 1.93±0.01 a 1.81±0.00 b 1.33±0.04 c 酸不可溶性木质素 Acid insoluble lignin (AIL) 叶片Leaf 12.22±2.60 c 14.51±1.42 b 17.07±0.59 a 叶柄Petiole 14.90±1.69 b 19.30±1.27 a 20.36±1.09 a 酸不可溶性木质素/酸可溶性木质素 AIL/ASL 叶片Leaf 7.71±1.55 b 9.42±0.78 b 13.05±0.26 a 叶柄Petiole 7.71±0.80 c 10.66±0.65 b 15.35±0.31 a 标以不同大小写字母值分别表示在0.01或0.05的水平上差异显著。 Values followed by different capital and small letters are significantly different at 0.01 or 0.05 probability levels, respectively.

表1 病圃中不同抗性棉花品种细胞壁木质素含量 Table 1 Content of lignin in three different cotton varieties in the disease nursery

在陆地棉耐病品种冀棉20和感病品种邯208中, Laccase基因在较短时间内对病原菌侵染迅速应答, 其中冀棉20接种黄萎病菌后, Laccase表达量较0 h升高9~14倍, 在8 h时达到最高并在72 h内一直维持较高水平, 且在各检测时间点均显著高于邯208, 后者的表达量较0 h仅升高1~6倍(图4), 说明漆酶基因 Laccase的表达丰度与陆地棉品种抗病性高低完全一致。 Laccase在海岛棉Pima 90-53中的表达量较0 h升高1~4倍, 其表达水平与在邯208中相近。

图4

Fig. 4

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	图4 黄萎病侵染后不同棉花品种漆酶 Laccase表达分析Fig. 4 RT-PCR analysis of Laccase in different varieties inoculated with V. dahliae