分别于2010—2012年的11月至2月在海南三亚南滨农场中国农业科学院作物科学研究所三亚试验基地(18°23° N, 108°56° E)种植原产黑龙江第二、第三、第四积温带的大豆品种黑河43、克山1号、北丰11、丰收25、丰收27、合丰25和绥农14, 生育期组在MG00~0之间^{[ 8, 9]}。

分期播种7个品种, 分别于2010年11月6日和2011年12月1日播种第一期, 以后每6 d播种一期, 共4期。每个品种种植1垄, 垄上播种2行, 行长6 m, 垄距0.7 m, 株距0.05 m。设置自然短日照和人工补光长日照(18 h)处理。LD处理是在大豆子叶展开期(VC)之前开始补光, 到盛花期(R2)^{[ 10]}结束, 每日补光时间从17:40至次日0:40, 采用200 W白炽灯补光, 光源距地面高度1.5 m, 地面光照强度约40 μmol s^-1 m^{-2 [ 11]}。

试验设3个因素共计18个处理(表1)。亲本光照处理方法设为因素A, 其中, 父、母本均为自然短日照的处理设为A1, 父、母本均长日照处理为A2, 母本自然短日照、父本长日照处理为A3。杂交技术设为因素B, 其中, 改良去雄蕊杂交技术(简称去雄杂交技术)为B1, 杂交时去掉母本花冠但保留雄蕊^{[ 12]} (简称不去雄杂交技术)为B2。杂交时所选母本花蕾大小为因素C, 其中, 大花蕾为C1, 其柱头高于雄蕊并与雄蕊分离, 雄蕊达到或高出萼筒口; 中花蕾为C2, 其柱头高于雄蕊, 雄蕊位于萼筒中部与萼筒口之间; 小花蕾为C3, 其雄蕊在萼筒中部以下位置, 柱头高于雄蕊而低于萼筒口处。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 试验处理内容 Table 1 Information of experiment treatments 处理序号 Treatment No. 光照处理 Photoperiodic treatment 母本去雄与否 Emasculation or not 母本花蕾大小 Female flower bud size 母本 Female 父本 Male 1 自然短日照NSD 自然短日照NSD 去雄Emasculation 大花蕾 Big 2 自然短日照NSD 自然短日照NSD 去雄Emasculation 中花蕾 Middle 3 自然短日照NSD 自然短日照NSD 去雄Emasculation 小花蕾 Small 4 自然短日照NSD 自然短日照NSD 不去雄Nonemasculation 大花蕾 Big 5 自然短日照NSD 自然短日照NSD 不去雄Nonemasculation 中花蕾 Middle 6 自然短日照NSD 自然短日照NSD 不去雄Nonemasculation 小花蕾 Small 7 长日照LD 长日照LD 去雄Emasculation 大花蕾 Big 8 长日照LD 长日照LD 去雄Emasculation 中花蕾 Middle 9 长日照LD 长日照LD 去雄Emasculation 小花蕾 Small 10 长日照LD 长日照LD 不去雄Nonemasculation 大花蕾 Big 11 长日照LD 长日照LD 不去雄Nonemasculation 中花蕾 Middle 12 长日照LD 长日照LD 不去雄Nonemasculation 小花蕾 Small 13 自然短日照NSD 长日照LD 去雄Emasculation 大花蕾 Big 14 自然短日照NSD 长日照LD 去雄Emasculation 中花蕾 Middle 15 自然短日照NSD 长日照LD 去雄Emasculation 小花蕾 Small 16 自然短日照NSD 长日照LD 不去雄Nonemasculation 大花蕾 Big 17 自然短日照NSD 长日照LD 不去雄Nonemasculation 中花蕾 Middle 18 自然短日照NSD 长日照LD 不去雄Nonemasculation 小花蕾 Small NSD: normal short day; LD: long day.

表1 试验处理内容 Table 1 Information of experiment treatments

改良去雄蕊杂交技术是在许海涛等^{[ 13]}方法的基础上进行两项改进, 一是将母本旗瓣下萼筒撕出一个“V”型断面, 使柱头下的单体花药外露, 以便去除; 二是将父本花药轻轻触碰母本柱头, 而不是将花粉涂抹在柱头上。不去雄杂交是将母本花蕾的萼片及花冠去除后不去除雄蕊, 其他授粉等措施与去雄杂交技术相同。选取7个试验材料中的6个品种用于配制杂交组合, 每个处理均配制北丰11 (♀) × 黑河43 (♂)、丰收25 (♀) × 克山1号(♂)及合丰25(♀) × 绥农14 (♂) 3个组合, 所有杂交工作均由同一杂交技术熟练人员完成。

在盛花期(R2)调查7个品种花朵数量、花粉数量、花粉育性、花蕾大小和花朵重量, 用电子天平称量花朵重量, 游标卡尺测量花蕾大小, 用1%碘-碘化钾(I-KI)染色法^{[ 14]}测定花粉育性, 在Leica DM4000B显微镜下观测。按Fehr和Caviness^{[ 10]}提出的大豆生育时期分期标准记载生育时期。

杂交时记载各处理的杂交花朵数量、成活荚数、粒数。在F₁代鉴定真假杂种, 由于所配制的杂交组合均以白花品种作母本, 紫花品种为父本, 故F₁植株开紫花为真杂种。

杂交成活率(%)=获得杂交荚数/杂交花朵数×100

真杂种率(%)=真杂交粒数/获得杂交粒数×100

杂交成功率(%)=杂交成活率×真杂种率×100

采用DPS软件^{[ 15]}分析数据, Duncan’s新复极差法检验处理间差异显著性。

在南繁自然短日照条件下, 东北春大豆植株矮小, 而长日(LD)处理可使大豆生长繁茂, 平均株高、茎粗、节数、花朵数均比自然短日照(NSD)材料高, 增幅分别为200.7%、42.0%、39.8%和99.1%, 差异均达极显著水平( P<0.01)(表2)。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 不同光照处理材料的株高、节数、茎粗及花朵数 Table 2 Plant height, stem diameter, node number and flower number of soybean under different treatments 性状 Trait 长日照 LD 自然短日照 NSD (LD-NSD)/NSD (%) 株高 Plant height (cm) 73.6±3.4 A 24.5±3.1 B 200.7 茎粗 Stem diameter (mm) 7.2±0.5 A 5.1±0.5 B 42.0 主茎节数 Node number on the main stem 15.3±1.1 A 11.0±0.8 B 39.8 单株花朵数 Flower number per plant 102.8±7.1 A 51.6±4.2 B 99.1 数据后不同字母表示在0.01水平上差异显著。 Values followed by different letters are significantly different at 0.01 probability level. NSD: normal short day; LD: long day.

表2 不同光照处理材料的株高、节数、茎粗及花朵数 Table 2 Plant height, stem diameter, node number and flower number of soybean under different treatments

2010年和2011年播种的第一期材料(播种期分别为11月6日和12月1日)在长日照下生长时, 出苗至初花(VE至R1)日数分别为28 d和30 d, 初花至盛花(R1~R2)分别为12 d和10 d, 初花至始荚(R1~R3)分别为25 d和20 d; 同期播种的材料在自然短日照(NSD)下, 出苗至初花(VE~R1)分别需要19 d和27 d, 初花至盛花(R1~R2)分别为6 d和4 d, 初花至始荚(R1~R3)分别为10 d和6 d。可以看出, 长日照处理可以延长大豆开花期, 早播材料的开花期比晚播的长。不同年份材料发育时期长度有一定差异的原因可能是播种期不同, 温度不一致。

与自然短日照(NSD)处理相比, 长日照(LD)处理材料的花朵及其组成部分均变大, 差异达极显著水平( P<0.01)(表3)。LD条件下萼筒高度、直径均比NSD大, 去雄蕊时有较大空间, 不易碰伤柱头, 有助于提高杂交成活率。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 不同光照处理对花器官形态的影响 Table 3 Effects of different photoperiod treatments on the morphological traits of flower 花器官形态学特性 Morphological trait of flower 长日照 LD (mm) 自然短日照 NSD (mm) (LD-NSD)/NSD (%) 花托底至萼片顶端高度 Height from receptacle bottom to sepal top 7.2±0.7 mm A 5.4±0.5 mm B 32.7 花托底至花瓣顶端高度 Height of receptacle bottom to petal top 7.5±0.3 mm A 4.6±0.6 mm B 62.9 萼筒高度 Sepal tube height 2.9±0.3 mm A 2.1±0.2 mm B 38.5 花托底至花丝顶端高度 Height from receptacle bottom to filament top 5.0±0.2 mm A 3.4±0.5 mm B 44.3 萼筒口直径 Sepal tube diameter 2.4±0.2 mm A 2.1±0.2 mm B 16.8 萼筒口至花丝顶端高度 Height from sepal tube gap to the filament top 2.1±0.2 mm A 1.35±0.4 mm B 53.3 数据后不同字母表示在0.01水平上差异显著。 Values followed by different letters are significantly different at 0.01 probability level. NSD: normal short day; LD: long day.

表3 不同光照处理对花器官形态的影响 Table 3 Effects of different photoperiod treatments on the morphological traits of flower

长日照处理下大豆单个花朵的平均花粉数量为5038.1个, 比自然短日照下多48.43%。大豆单体花药和单个花朵的花粉数量在长日照和自然短日照处理间的差异均达到极显著水平( P<0.01)(表4)。大豆具有九合一离的二体雄蕊, 这10个雄蕊在花蕾中排成上下2层^{[ 16]}。在单个花朵内部, 上层花药比下层花药的平均花粉数量多(表4)。采用1%碘-碘化钾(I-KI)染色法在光学显微镜下观测花粉败育率, t检验结果显示, 在2种光照处理间, 上层花药、下层花药、单体花药和单个花朵的花粉败育率均以自然短日照处理为高, 差异达到极显著水平( P<0.01)。可见在南繁自然短日照条件下, 大豆花粉数量明显减少, 且花粉败育率高, 这是南繁条件下杂交成活率低下的重要原因。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 不同光照条件下大豆花粉数量和败育率的比较 Table 4 Comparisons of pollen number and abortion rate under different photoperiod treatments 性状 Trait 花粉数量 Pollen number 花粉败育率 Pollen abortion rate (%) 长日照 LD 自然短日照NSD (LD-NSD)/NSD (%) 长日照 LD 自然短日照NSD (LD-NSD)/NSD 上层花药 Upper anther 634.5±116.9 A 288.0±78.4 B 120.3 18.0±8.8 a 11.9±4.8 b 51.2 下层花药 Lower anther 356.1±64.5 A 113.2±48.7 B 214.6 40.7±14.2 A 20.6±5.6 B 97.2 单体花药 Single anther 441.1±79.4 A 135.2±50.0 B 226.3 30.6±12.3 A 12.6±4.7 B 142.3 单个花朵 Single flower 5038.1±785.4 A 2028.0±511.2 B 148.4 29.8±9.4 A 15.0±4.3 B 97.8 数据后不同字母表示在0.01水平上差异显著。 Values followed by different letters are significantly different at 0.01 probability level. NSD: normal short day; LD: long day.

表4 不同光照条件下大豆花粉数量和败育率的比较 Table 4 Comparisons of pollen number and abortion rate under different photoperiod treatments

2.4.1 杂交成活率 方差分析表明, 亲本光照处理(因素A)间和母本花蕾大小处理(因素C)间均存在极显著差异( P<0.01), 杂交技术(因素B)间存在显著差异( P<0.05)。而A×B、B×C、A×B×C的互作均不显著。就单个因素而言, 母本为短日照、父本为长日照的处理杂交成活率最高。采用去雄杂交技术时, 父母本同为自然短日照处理、父母本同为长日照处理和母本为自然短日照处理、父本为长日照处理时的杂交成活率分别是22.78%、46.20%和61.08%; 采用不去雄杂交技术, 相应的杂交成活率分别是34.01%、56.82%和68.70%, 比采用去雄技术的处理平均高出10%左右。母本植株上待授粉花蕾对应的杂交成活率均表现为大花蕾>中花蕾>小花蕾。

2.4.2 真杂种率 母本上杂交用花蕾的大小对杂交种真伪影响很大。计算2年试验中不同光照处理下真杂种率的平均值, 结果显示, 分别选大、中、小花蕾进行杂交时, 若母本去雄, 三者的真杂种率依次为98.3%、94.8%和8.3%; 若母本不去雄, 真杂种率分别为92.8%、86.5%和0 (表5)。可见, 选取母本上大花蕾做杂交的真杂种率比中花蕾和小花蕾都高, 去雄比不去雄时的真杂种率高。

表5

Table 5

表5(Table 5)

表5 不同光照处理下采用两种杂交技术时的真杂种率 Table 5 True hybrid rate of different hybriding techniques under different photoperiod treatments (%) 光照处理Photoperiodic treatment 母本花蕾类型 Size of female flower bud 去雄Emasculation 不去雄Nonemasculation 母本Female 父本Male 2010-2011 2011-2012 2010-2011 2011-2012 NSD NSD 大花蕾Big 100.0 100.0 100.0 90.9 88.9 89.9 NSD NSD 中花蕾Middle 90.9 100.0 95.5 83.3 87.5 85.4 NSD NSD 小花蕾Small 0 0 0 0 0 0 LD LD 大花蕾Big 100.0 100.0 100.0 90.0 100.0 95.0 LD LD 中花蕾Middle 100.0 83.3 91.7 77.9 88.9 83.3 LD LD 小花蕾Small 50.0 0 25.0 0 0 0 NSD LD 大花蕾Big 88.9 100.0 94.5 90.9 96.3 93.6 NSD LD 中花蕾Middle 100.0 94.1 97.1 85.7 96.2 90.9 NSD LD 小花蕾Small 0 0 0 0 0 0 大花蕾平均值 Big bud average 96.3 100.0 98.2 90.6 95.1 92.8 中花蕾平均值 Middle bud average 97.0 92.5 94.8 82.3 90.9 86.5 小花蕾平均值 Small bud average 16.7 0 8.3 0 0 0 NSD: 自然短日照; LD: 长日照。 NSD: normal short day; LD: long day.

表5 不同光照处理下采用两种杂交技术时的真杂种率 Table 5 True hybrid rate of different hybriding techniques under different photoperiod treatments (%)

2.4.3 杂交成功率 由于用大花蕾进行授粉的杂交成活率及真杂种率均比用中花蕾和小花蕾高, 所以本研究只对大花蕾的杂交成功率进一步分析。由表6可以看出, 采用去雄蕊杂交技术时, 父母本均为自然短日照处理、父母本均为长日照处理和母本为自然短日照、父本为长日照处理的杂交成功率分别为22.8%、46.2%和57.8%; 采用不去雄杂交技术时, 三者的杂交成功率分别为30.7%、54.3%和64.4%。可见, 尽管去雄后使真杂种率有一定幅度的提高, 但因不去雄时杂交成活率明显高于去雄处理, 使不去雄处理比去雄处理的杂交成功率平均高8%左右, 其中, 以母本为自然短日照、父本为长日照处理材料的杂交成功率最高, 达到64.36%。

表6

Table 6

表6(Table 6)

表6 大花蕾作母本时不同处理的杂交成功率 Table 6 Hybridization success rate of big flowers on the female parent plants under different photoperiod treatments 光照处理 Photoperiodic treatment 杂交技术 Hybrid technique 杂交成功率 Hybrid ization success rate (%) 显著性测验 Significance test 母本Female 父本Male 2010-2011 2011-2012 0.05 0.01 NSD LD 不去雄Nonemasculation 60.6 68.1 64.4 a A NSD LD 去雄Emasculation 53.3 62.2 57.8 a AB LD LD 不去雄Nonemasculation 45.0 63.6 54.3 ab AB LD LD 去雄Emasculation 36.8 55.6 46.2 b B NSD NSD 不去雄Nonemasculation 37.0 24.3 30.7 c C NSD NSD 去雄Emasculation 21.7 23.8 22.8 c C NSD: 自然短日照; LD: 长日照。 NSD: normal short day; LD: long day.

表6 大花蕾作母本时不同处理的杂交成功率 Table 6 Hybridization success rate of big flowers on the female parent plants under different photoperiod treatments

本研究的结果表明, 在南繁自然短日照条件下, 大豆开花持续时间短, 花朵数量少, 此外, 短日照使大豆花朵减轻, 花器官变小, 花丝生长纤弱且扭曲, 花药干瘪, 花粉数量少, 花粉败育率高。利用1% I-KI染色测定花粉育性的结果也表明, 干瘪的花药里不育花粉数量明显增多, 而饱满的花药中则不育花粉数量明显减少, 这与我们根据花器官形态推测的结果一致。所以, 在南繁自然短日照下, 大豆花期持续时间短、花朵数量少、花朵小和花粉败育率高是导致杂交成功率低下的重要原因。

南繁时进行长日照处理可使东北早熟春大豆的植株营养体变大, 花期延后, 开花持续时间延长, 花朵变大, 花丝生长粗壮且直立, 花药饱满, 花粉数量多, 花粉败育率低。可见, 通过人工光源延长光照时间是解决南繁条件下大豆花朵数量少、花朵小和花粉败育率高等问题的有效途径。

采用不去雄杂交技术可以避免或减轻杂交时对柱头的伤害, 提高杂交成功率, 这与前人的研究结果一致^{[ 16, 24]}。同时, 采用该项技术可节省时间, 在有限的时间内进行更多的杂交操作, 进而收获足够的杂交荚数。花朵大小反映花朵发育状况, 大花蕾发育充分, 花粉数量多, 败育率低, 则杂交成功率高。在杂交时还要准确把握授粉时间。一般来说, 大豆自花授粉发生在花冠高度与最高花萼高度相同或相近时^{[ 25, 26]}, 人工杂交应在此前进行。

在3种父、母本光照处理组合中, 母本为自然短日照、父本为长日照处理的材料杂交成功率最高, 可能的原因有三: (1)自然短日照下花朵少, 营养竞争小, 杂交花荚不易自然脱落。(2)自然短日照下母本植株花期集中, 花朵大小更易界定, 容易选定大花蕾。(3)长日照下父本花粉量充足且花粉育性好。在本试验中, 11月上旬播种的材料出苗至初花(VE~ R1)和花期(R1~R3)比NSD分别延长9 d和15 d, 因此, 建议在11月上旬播种父本, 出苗后进行补光处理, 在父本播种7 d后播种母本, 之后每5 d播种一次, 共播种4次, 以保证父母本花期相遇, 有效延长杂交时间。

根据本试验结果, 提出了南繁条件下提高大豆杂交成功率的综合技术方案: (1)父本适期早播并进行18 h长日照处理, 母本在自然短日照条件下错后分期播种; (2)花期精细管理, 保持充足的水肥供应; (3)在母本植株上选取与父本花期相遇的大花蕾进行杂交; (4)选择温度适宜的天气和时段杂交; (5)杂交前去掉母本花冠但保留雄蕊, 去掉花冠后尽快授粉; (6)加强杂交花朵和母本植株的后期管理。需要注意的是, 本研究所用材料均为东北地区早熟品种, 对光周期相对钝感^{[ 27, 28]}。进行黄淮海或南方大豆南繁杂交时, 对父本长日照处理的光照时间应适当缩短。

由于大豆对光周期敏感^{[ 27]}且品种差异大^{[ 28]}, 在高纬度地区同期播种时, 不同地区来源的材料常因花期不遇, 难以相互杂交。我国各产区大部分大豆品种是以所在生态区材料为亲本选育而成的, 遗传基础相当狭窄^{[ 29]}。盖钧镒等^{[ 30]}指出, 在1995年之前, 中国东北、黄淮海和南方大豆产区绝大多数育成品种的遗传基础存在严重的地区局限性。在随后的十多年里, 中国大豆育成品种遗传基础虽有所拓宽, 但亲本来源仍比较有限^{[ 31]}。王彩洁等^{[ 32]}利用与大豆产量、品质、抗逆性、适应性等重要性状相关的SSR标记对东北和黄淮海地区自20世纪40年代以来大面积种植的大豆品种进行遗传多样性分析, 结果表明, 自南向北大面积种植品种SSR标记的多态性呈逐渐降低的趋势, 即东北地区大面积推广品种的遗传基础比黄淮海地区品种更为狭窄^{[ 33]}。因此, 加强地理远缘种质资源的利用是拓宽我国特别是东北地区大豆遗传基础的必要途径。本研究通过对亲本材料的光照处理和改进杂交技术等措施, 显著提高了南繁条件下的大豆杂交成功率, 在此基础上提出了南繁条件下大豆杂交的综合技术方案, 可以有效地解决南繁时杂交成功率低下的问题, 便于充分利用地理远缘大豆材料配制杂交组合, 拓宽大豆的遗传基础。所以, 该项技术在大豆育种中具有广泛的应用前景。