34份棉花品种(系), 包括33份陆地棉材料和1份海岛棉抗黄萎病品种海7124 (表1)。33份陆地棉材料包括: 黄河流域棉区11个, 长江流域棉区8个, 西北内陆棉区9个, 北部特早熟棉区2个; 感黄萎病品系军棉1号, 抗黄萎病品系60182, 以及陆地棉遗传标准系TM-1。TRV-VIGS体系的构建以及 GhMAPKKK的功能研究均以海7124为研究材料。同时诱导34份材料 GhCLA1基因沉默, 观察叶片的白化情况, 以研究TRV病毒在不同遗传背景材料中的适用性。

pTRV1和pTRV2 VIGS载体由清华大学刘玉乐教授惠赠。农杆菌GV3101由本实验室保存。MES (Sigma原装)及卡那霉素、利福平、乙酰丁香酮等主要国产生化试剂, 均购自南京奥斌生物科技有限公司。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 供试的34份棉花品种(品系)基本信息 Table 1 Information on 34 tested cotton varieties (lines) 序号 No. 品种(品系) Variety (line) 推广生态区 Ecological region 引进/审定年份 Introduced or released year 1 科遗2号 Keyi 2 黄河流域 The Basin of Yellow River 1970 2 中棉所12 CRI 12 黄河流域 The Basin of Yellow River 1989 3 豫棉8号 Yumian 8 黄河流域 The Basin of Yellow River 1992 4 豫棉9号 Yumian 9 黄河流域 The Basin of Yellow River 1994 5 豫棉11 Yumian 11 黄河流域 The Basin of Yellow River 1994 6 晋棉21 Jinmian 21 黄河流域 The Basin of Yellow River 1997 7 晋棉25 Jinmian 25 黄河流域 The Basin of Yellow River 1998 8 豫棉20 Yumian 20 黄河流域 The Basin of Yellow River 1999 9 中棉所9409 CRI9409 黄河流域 The Basin of Yellow River 1999 10 冀棉298 Jimian 298 黄河流域 The Basin of Yellow River 2004 11 银瑞361 Yinrun 361 黄河流域 The Basin of Yellow River 2007 12 鄂棉6号 Emian 6 长江流域 The Basin of Yangtze River 1970 13 鄂荆1号 Ejing 1 长江流域 The Basin of Yangtze River 1991 14 鄂棉17 Emian 17 长江流域 The Basin of Yangtze River 1992 15 泗棉3号 Simian 3 长江流域 The Basin of Yangtze River 1993 16 鄂棉21 Emian 21 长江流域 The Basin of Yangtze River 1996 17 鄂抗棉9号 Ekangmian 9 长江流域 The Basin of Yangtze River 1999 18 鄂抗棉10号Ekangmian 10 长江流域 The Basin of Yangtze River 1999 19 华抗棉1号Huakangmian 1 长江流域 The Basin of Yangtze River 2002 20 新陆中2号Xinluzhong 2 西北内陆 Northwestern inland 1988 21 新陆早1号Xinluzao 1 西北内陆 Northwestern inland 1990 22 新陆早7号 Xinluzao 7 西北内陆 Northwestern inland 1997 23 新陆中8号 Xinluzhong 8 西北内陆 Northwestern inland 1999 24 新陆早13 Xinluzao 13 西北内陆 Northwestern inland 2002 25 新陆早22 Xinluzao 22 西北内陆 Northwestern inland 2005 26 新陆早30 Xinluzao 30 西北内陆 Northwestern inland 2006 27 新陆中26 Xinluzhong 26 西北内陆 Northwestern inland 2006 28 新陆中35 Xinluzhong 35 西北内陆 Northwestern inland 2007 29 朝阳棉1号 Zhaoyangmian 1 北部特早熟 Northern (early mature) 1957 30 锦棉6号 Jinmian 6 北部特早熟 Northern (early mature) 1996 31 军棉1号 Junmian 1 感黄萎病品系 Cotton line susceptible to Verticillium dah l iae 1979 32 60182 抗黄萎病品系 Cotton line resistant to Verticillium dah l iae 33 TM-1 陆地棉遗传标准系 Genetic standard line of upland cotton 34 海7124 Hai 7124 海岛棉品种 G. barbadense cv. Hai 7124

表1 供试的34份棉花品种(品系)基本信息 Table 1 Information on 34 tested cotton varieties (lines)

参考Velásquez等的制备方法^{[ 17]}。以pTRV1和含有目的基因片段的pTRV2分别转化农杆菌GV3101。挑取新鲜培养的含pTRV1和目的基因片段的pTRV2的农杆菌GV3101单菌落, 分别接种到3 mL LB液体培养基(Kan, 50 μg mL^-1; Rif, 50 μg mL^-1)中, 28℃ 180转 min^-1培养24 h; 以1%含量接入50 mL LB液体培养基 (Kan, 50 μg mL^-1; Rif, 50 μg mL^-1)中, 28℃ 180转 min^-1培养12 h, 至菌液OD₆₀₀为1.0左右; 1700× g离心5 min收集菌体细胞, 以适当体积的重悬液(10 mmol L^-1 MgCl₂, 10 mmol L^-1 MES以及200 μmol L^-1乙酰丁香酮)重悬至终浓度为0.8 (OD₆₀₀); 将重悬液于室温下静置3 h以上, 含有pTRV1和目的基因片段的pTRV2的重悬液按体积比1∶1混匀, 用于注射棉花子叶。

以人工气候室培养到出苗后8 d, 子叶完全展平的棉花幼苗为试验接菌材料。先用注射器针头轻轻刺破子叶背面造成微伤口, 用去针头的注射器从伤口处注入1∶1混匀的含有pTRV1和含目的基因片段的pTRV2重悬液。于昼/夜温度23/22℃, 光/暗周期16 h/8 h的人工气候室内培养侵染后的棉花植株。在相同的环境下培养未经侵染处理和注射空载体(1∶1混和pTRV1和pTRV2)的对照植株, 2~5周观察不同处理棉花的表型, 并检测目的基因的表达情况。对每种材料处理10个单株。

利用CTAB-酸酚法提取叶片总RNA^{[ 18]}。以棉花 Actin 9(GenBank登录号为AY305737)为内参基因, 通过半定量RT-PCR检测沉默后目的基因的表达。棉花 Gh CLA1、 Gh MAPKKK和 Gh Actin 9的半定量RT-PCR引物以及检测TRV病毒的RT-PCR引物见表2。

将大丽轮枝菌菌株Vd8涂布于固体土豆培养基表面, 23℃培养3~4 d; 后转移到液体培养基中, 振荡培养3~5 d; 用无菌蒸馏水将孢子洗脱下, 将孢子浓度调节到每毫升10⁷个。

将含有pTRV1和pTRV2-GhMAPKKK的农杆菌重悬液等量混合后注射棉花子叶, 沉默 Gh MAPKKK, 2周后用浸根法接种Vd8菌株的孢子液。接菌4周后调查发病情况, 采用0~4级方法统计病级^{[ 19, 20]}。对每种材料处理10个单株。设3个生物学重复。

2.1.1 棉花 CLA1基因的克隆及pTRV2-GhCLA1载体构建 以NCBI中释放的拟南芥 CLA1基因序列(GenBank登录号为AT4g15560)为探针, 搜索雷蒙德氏棉( G. raimondiiUlbrich)全基因组序列^{[ 15]}, 获得其序列信息(Gorai.011G184200.2), 进一步设计引物, 从陆地棉遗传标准系TM-1中克隆 GhCLA1基因 (GenBank登录号为KJ123647)。其ORF全长2163 bp, 编码720个氨基酸。序列相似性分析表明, 该基因与拟南芥 CLA1基因的氨基酸相似性为83.0%。而来自雷蒙德氏棉和陆地棉TM-1中的 CLA1同源基因其核苷酸和氨基酸序列相似性均达99%以上, 非常保守。进一步设计PCR引物, 并在引物的5'端分别加入限制性内切酶 EcoR I和 Kpn I的酶切位点和保护碱基(表2), 扩增位于棉花 GhCLA1基因ORF中部994~ 1414 bp基因片段, 目标扩增片段长度为421 bp。经测序验证后, 将该基因片段插入沉默载体pTRV2, 获得重组载体pTRV2-GhCLA1。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 本研究所用引物 Table 2 Primers used in this study 基因 Gene 引物序列 Sequence (5¢-3¢) 用途 Purpose GhCLA1 F: GGAATTCCACAACATCGATGATTTAG R: GGGGTACCATGATGAGTAGATTGCAC 构建CLA1沉默载体所用引物(下画线为 EcoR I和 KpnI位点) Construction of CLA1 silencing vector (underlines are EcoR I and Kpn I sites, respectively) GhCLA1 F: GCCCTTTGTGCATCTTC R: CTCTAGGGGCATTGAAG 沉默CLA1后 CLA1基因RT-PCR分析 CLA1 expression analysis by RT-PCR after silence GhMAPKKK F: CCGGAATTCTGTTCCGGAGATTCCTGATCG R: CGAGCTCAGGTCTTGTCCTTGGCGAGGT 黄萎病菌诱导后 GhMAPKKK的RT-PCR分析 GhMAPKKKexpression analysis by RT-PCR after V. dahliainfection GhMAPKKK F: CCGGAATTCTGTTCCGGAGATTCCTGATCG R: CGAGCTCAGGTCTTGTCCTTGGCGAGGT 构建 GhMAPKKK沉默载体所用引物(下划线为 EcoR I 和 Sac I位点) Construction of GhMAPKKKsilencing vector (underlines are EcoR I and Sac I sites, respectively) GhMAPKKK F: GCCTTGCCTAACACAAGAAC R: GGATTGAACCACCAGAGACA 沉默 GhMAPKKK后 GhMAPKKK的RT-PCR分析 GhMAPKKKexpression analysis by RT-PCR after silence GhActin9 F: CCTCCGTCTAGACCTTGCTG R: TCATTCGGTCAGCAATACCA 内标对照 Reference gene as control TRV-RNA2 TCCCCTATGGTAAGACAATGAG 反转病毒RNA2的特异引物 Primer for reverse-transcription of RNA2 TRV-RNA2 F: TGGAGTTGAAGAGTTATTACCGAAGG R: CCGGAATTCGAAACTCAAATGCTACCAA 通过扩增TRV-RNA2来检测病毒的扩散 Detection of virus spread by amplifying TRV-RNA2 in plants

表2 本研究所用引物 Table 2 Primers used in this study

2.1.2 棉花TRV-VIGS体系的建立 以未注射农杆菌及注射含pTRV1/pTRV2空载体的农杆菌混合液的植株为对照, 用含有pTRV1/pTRV2- GhCLA1的农杆菌混合液侵染海岛棉海7124出苗8 d的子叶, 两周后观察真叶表型。结果表明注射pTRV1/pTRV2空载体的幼苗叶片未呈现白化, 表型与未经侵染的对照无异。而注射pTRV1/pTRV2-GhCLA1植株, 其真叶表现为叶脉及边缘部白化, 逐渐扩散到整个叶片; 从第2片真叶起, 白化现象明显, 新生叶几乎完全白化(图1)。

图1

Fig. 1

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图1 沉默棉花 GhCLA1的白化表型A: 整株表型, 左为接种pTRV1和pTRV2空载体对照, 右为接种pTRV1和pTRV2-GhCLA1植株的真叶表型。B: 叶片沉默效果。从左到右: 第一片真叶到第四片真叶。Fig. 1 Albino phenotype of GhCLA1silenced cotton plantsA: phenotype of cotton plant, the left is a control plant inoculated with pTRV1/pTRV2 constructs, the right is a cotton plant inoculated with pTRV1/pTRV2-GhCLA1 constructs; B: phenotype of GhCLA1 silenced cotton leaves; from left to right: the first to the fourth true leaves.

为检测TRV在棉花植株中的扩散情况, 提取注射pTRV1和pTRV2空载体3周后的棉株根、茎、叶组织RNA, 利用TRV-RNA2特异引物将病毒RNA2反转为cDNA, 并设计特异性引物扩增病毒RNA2序列片段, 以检测病毒在棉花不同组织器官的扩散。RT-PCR分析表明子叶接种病毒后, 病毒RNA在棉花根、茎、叶中均有积累(图2), TRV病毒侵染棉花后可扩散到棉花多种组织器官中, 为利用该体系高通量验证根、茎、叶等组织器官优势表达目标基因功能提供了依据。

图2

Fig. 2

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	图2 通过RT-PCR分析TRV在棉花不同组织中的扩散1: pTRV2质粒; 2: 未侵染叶cDNA; 3: 侵染叶cDNA; 4: 侵染茎cDNA; 5: 侵染根cDNA。Fig. 2 Spreading of TRV virus in different cotton tissues analyzed by RT-PCR1: pTRV2 plasmid; 2: uninfected leaf cDNA; 3: infected leaf cDNA; 4: infected stem cDNA; 5: infected root cDNA.

对pTRV1/pTRV2-GhCLA1处理3周后, 白化表型明显的植株和仅空载体侵染处理的对照植株, 提取叶片总RNA, 通过半定量RT-PCR的方法检测 GhCLA1基因的表达水平。结果表明, 与对照相比, 侵染pTRV1/pTRV2-GhCLA1的植株 GhCLA1基因几乎不表达, 沉默效果明显(图3)。

图3

Fig. 3

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	图3 半定量RT-PCR分析 CLA1基因沉默的效果Fig. 3 CLA1 expression in silenced and non-silenced cotton plants detected by semi quantitative RT-PCR

2.1.3 棉花TRV-VIGS体系利用的广谱性 选择不同来源, 不同生态区的34份棉花材料, 进行沉默体系重复。以注射pTRV1/pTRV2空载体的植株为对照, 用含有pTRV1/pTRV2-GhCLA1的农杆菌混合液注射34份供试棉种子叶完全展平的幼苗, 诱导棉花 CLA1基因沉默。侵染3周后统一调查第2片真叶白化表型(图4)。发现在供试的不同棉种材料中, 其 CLA1抑制程度有差异, 如新陆早1号、朝阳棉1号、TM-1以及海7124等整个叶片白化, 中棉所12、晋棉25、豫棉20及华抗棉1号等叶脉明显白化, 叶肉轻度失绿。说明TRV病毒可应用于所有供试材料的 CLA1基因沉默, 但不同的棉花品种对TRV病毒的敏感性存在差异。利用TRV-VIGS技术诱导目的基因沉默受体遗传背景影响较小, 可广泛用于来源不同棉花资源材料中目标基因的功能鉴定。

图4

Fig. 4

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	图4 34份不同来源棉花品种/品系TRV-VIGS诱导 GhCLA1基因沉默表型编号对应的材料见表1。每一材料上方为注射空载体对照, 下方为沉默 GhCLA1基因的叶片。Fig. 4 Photobleaching phenotype of GhCLA1silenced cotton plants in 34 cotton varieties (lines)Code numbers of cotton varieties correspond with these in Table 1. In each column, the upper is the leaves of vector control plants and the lower is those of GhCLA1 silenced plants.

在MAPK信号通路中包含至少3个顺序的激活蛋白激酶, 依次为MAPKKKs、MAPKKs及MAPKs^{[ 21]}。MAPKKKs参与了病原物侵染植物后引起的过敏性反应^{[ 22]}。 GhMAPKKK(GenBank登录号为FJ966894)是棉花MAPKKKs家族中的一个成员, 本研究表明该基因受黄萎病菌诱导表达。以生长到二叶一心期的海7124幼苗为受体, 接种黄萎病菌株Vd8, 分别检测接种0、24、48、96和144 h后根组织中 GhMAPKKK基因的表达水平。RT-PCR分析表明, 随着接种时间增加, GhMAPKKK基因表达明显增强, 接种后96 h表达量达到高峰, 接种后144 h表达量开始降低(图5)。说明 GhMAPKKK参与棉花抗黄萎病信号传导途径。

图5

Fig. 5

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图5 GhMAPKKK在黄萎病菌诱导下的表达特征Fig. 5 Expression patterns of GhMAPKKK induced by Verticillium dahliae strain Vd8

利用TRV-VIGS体系进一步验证了 GhMAPKKK在黄萎病抗性中的功能。选择 GhMAPKKK基因靠近3'区1519~2077 bp碱基位置, 基因专化性强, 扩增出556 bp的目标片段, 克隆到pTRV2载体中获得重组质粒pTRV2-GhMAPKKK。用含有pTRV1/pTRV2- GhMAPKKK以及pTRV1/pTRV2-GhCLA1和pTRV1/ pTRV2空载体的农杆菌重悬液, 分别侵染海岛棉中抗黄萎病栽培品种海7124出苗8 d、子叶展平的幼苗。3周后, 注射TRV2- GhCLA1的植株出现明显白化。提取pTRV2-GhMAPKKK处理以及注射空载体的对照植株叶片总RNA, 通过半定量RT-PCR的方法检测表明, 与对照植株相比, 侵染pTRV2- GhMAPKKK的植株 GhMAPKKK基因的表达水平显著降低, 沉默效果明显(图6)。

图6

Fig. 6

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	图6 半定量RT-PCR分析 GhMAPKKK基因沉默效果Fig. 6 GhMAPKKKexpression in silenced and non-silenced cotton plants detected by semi-quantitative RT-PCR

对pTRV2-GhMAPKKK处理以及注射空载体的对照海7124植株, 接种大丽轮枝菌菌株Vd8。一个月后观察黄萎病的发病情况。通过3次生物学重复分析, 注射空载体的对照海7124植株, 其平均病情指数为21.9, 而 GhMAPKKK基因沉默后的海7124植株感病性增强, 其平均病情指数达41.25。表明 GhMAPKKK基因参与了黄萎病诱导的过敏反应(图7)。

图7

Fig. 7

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	图7 黄萎病菌侵染 GhMAPKKK基因沉默后的海7124表型上排和下排4株分别为 GhMAPKKK 沉默及注射空载体对照后接种黄萎病菌的表型。Fig. 7 Wilt symptom of GhMAPKKK silenced Hai 7124 plants inoculated with Verticillium dahliae strain Vd8Four plants on the upper and lower respectively: disease symptoms in GhMAPKKK silenced and vector control plants in response to Verticillium dahliainfection.