陆地棉徐州142及其无绒无絮突变体, 种植于中国农业科学院棉花研究所南试验场, 田间常规管理, 棉花生长期间, 分别采集野生型的根、茎、叶、花及野生型10个发育时期(-3、-1、0、1、3、5、10、15、20和25 DPA)的胚珠和纤维。将所有田间材料立即放入液氮速冻, 于-80℃冰箱保存备用。野生型拟南芥(Columbia)种植于本课题拟南芥培养室。所用数据库为雷蒙德氏棉D₅基因组数据库(http://cgp.genomics.org.cn/page/species/index.jsp)。

采用CTAB法提取棉花叶片的基因组DNA^{[ 20]}。利用TIANGEN公司RNA提取试剂盒参照说明书提取不同组织和各发育阶段棉花胚珠及纤维的总RNA。按TaKaRa (宝生物工程有限公司)反转录试剂盒说明书合成cDNA第1链, -20℃保存备用。

电子克隆以拟南芥( Arabidopsis thaliana, NM_ 113708)的AtMYB0蛋白序列为参比序列在雷蒙德氏棉( Gossypium raimondii) D₅基因组中比对调取与其相似的序列, 在徐州142野生型中进行 GhMYB0全长cDNA的克隆。采用Oligo6软件设计引物GhMYB0F和GhMYB0R (表1)。

以 GhMYB0为查询参比序列, 在NCBI的GenBank数据库中搜索与该基因同源的其他物种的氨基酸序列, 通过ClustalX2软件进行氨基酸序列比对, 进行保守结构域分析, 采用MEGA5.0软件的

Neighbor-Joining算法构建系统进化树, 用BootStrap检验, 并重复1000次系统进化分子; 用ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/)进行氨基酸基本理化性质分析; 利用Predictprotein (http://www.pre-dictprotein.org/)和SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分别预测跨膜区、功能位点和信号肽; 由ProtScale tool (http://expasy.org/tools/pscale/ Hphob.Woods.html)预测蛋白质的疏水性。

构建35s::GhMYB:GFP融合表达载体, 引物见表1。取一块长、宽大约4 cm的洋葱幼嫩表皮, 在固体MS培养基上22℃培养3~4 h。采用PDS-1000/ He基因枪(Bio-Rad)轰击洋葱表皮细胞, 可裂膜压力为1100 psi, 轰击距离约为9 cm。于22℃培养箱中培养被轰击的洋葱表皮细胞14~16 h, 于激光共聚焦显微镜下(Leica, TCS SP2)观察GFP的表达定位。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 GhMYB0基因克隆与表达所用引物 Table 1 Sequences of primers for GhMYB0isolation and expression 名称 Name 上游引物 Forward primer (5′→3′) 下游引物 Reverse primer (5′→3′) GhMYB0 ACAGAGAGAGAGAGAGAGAC TCGTCGTCGTCATATCAG In-GhMYB0 GGACTCTAGAGGATCCACAGAGAGAGAGAGAGAGAC GACCACCCGGGGATCCTCGTCGTCGTCATATCAG Ghhiston3-q GAAGCCTCATCGATACCGTC CTACCACTACCATCATGGC AtTUB-q AATGAAGCGAGTTGCGGTAG TCCCTTGGCCCAGTTGTTA GhMYB0-q CTAACCTTTGGGGAGTCATCA TGTCTCTCTCTCTCTCTCTGT

表1 GhMYB0基因克隆与表达所用引物 Table 1 Sequences of primers for GhMYB0isolation and expression

利用在线工具In-Fusion Primer Design Tool (http://bioinfo.clontech.com/infusion/convertPcrPrimers-Init.do)设计In-GhMYB0上下游引物(表1), 构建超表达载体。将扩增得到的片段利用凝胶电泳回收后, 采用In-Fusion HD Cloning System试剂盒(购自Clontech公司)与经 BamH I单酶切后线性化的pBI121植物表达载体(由中国农业科学院棉花所早熟课题组馈赠)相连接, 获得超表达载体。将超表达载体进行大肠杆菌(DH5α)转化, 由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。然后进行农杆菌转化(由中国农业科学院棉花所转基因课题组馈赠), 将得到的阳性菌液采用蘸花法侵染拟南芥野生型植株和 gl-1突变体^{[ 21]}, 收获成熟T₀代种子。T₀代种子经消毒后, 点播在MS选择培养板上(1‰卡那霉素)。4℃下春化3 d后, 移入光照培养箱(22℃恒温, 24 h光照, 光强30~40 µmol m^-2 s^-1)。10 d后挑选深绿色健康真叶和根伸长至培养基中的转化体。将转化体幼苗移入土中(营养土∶蛭石=1∶1, v/v), 至收获T₁代种子。经卡方检测, 筛选出符合3∶1分离比例的T₁代种子, 种植后获得T₂代纯系种子。同时, 提取3个转基因株系和野生型整株RNA后进行反转录, 用qRT-PCR方法检测目的基因在转基因株系中是否正常表达(PCR SYBR Green Real-time PCR Master Mix购自康为世纪), 检测上下游引物GhMYB0-q (表1)。利用SteREO Discovery.V8体视显微镜观察转基因拟南芥叶片及花器官。

分别提取徐州142的根、茎、叶、胚珠(0 DPA和5 DPA)、以及野生型和无绒无絮突变体不同发育时期(-3、-1、0、1、3、5、10、15、20和25 DPA)纤维的总RNA, 反转录成cDNA, 稀释8倍取2 μL用于qRT-PCR分析。以基因 Ghhiston3为内参, 比较不同组织器官不同发育期相对表达水平。反应在iCycler iQ5荧光定量PCR仪(Bio-Rad, USA)上进行, 采用SYBR Premix Ex Taq II试剂盒。反应体系为20 μL, 包括SYBR Premix Ex Taq II (2×) 10 μL、 10 μmol L^-1GhMYB0-q上下游引物各0.4 μL、模板cDNA 2 μL, 加ddH₂O至20 μL。PCR程序为95℃预变性10 min; 95℃变性15 s, 58℃退火30 s, 72℃延伸20 s, 40个循环; 最后72℃延伸5 min。设3个技术重复。荧光定量引物见表1。

采用电子克隆方法获得含有完整ORF的雷蒙德氏棉 GrMYB0基因, 利用特异引物GhMYB0F和GhMYB0R (表1)在陆地棉徐州142 cDNA中扩增, 产物ORF长度为843 bp, 编码280个氨基酸(图1)将该基因命名为 GhMYB0。通过氨基酸序列分析发现, 与雷蒙德氏棉D₅基因组调取的 GrMYB0相比, 保守结构域之外, 在陆地棉中克隆的 GhMYB0多9个氨基酸, 并存在7个氨基酸的差异(图2-A)。保守结构域分析发现, GhMYB0基因编码的蛋白具有典型的MYB转录因子R2和R3结构域(图2-B)。系统进化树分析发现, GhMYB0与棉花GhMYB4以及大豆GmMYB185归为一个小的类群(图3-A)。基因结构分析结果显示, GhMYB0编码区内仅含有一个内含子, 长度为86 bp (图3-B)。

图1

Fig. 1

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图1 棉花 GhMYB0全长核苷酸序列及推测编码的氨基酸序列方框代表起始密码子; *代表终止密码子。Rectangular frame: initiation codon; * termination codon.Fig. 1 Full-length nucleotide sequence and putative amino acid sequence of GhMYB0

图2

Fig. 2

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图2 GhMYB0氨基酸序列与雷蒙德氏棉及其他物种的氨基酸序列多重比对结果A: 灰色区域表示陆地棉 GhMYB0与雷蒙德氏棉 GrMYB0氨基酸序列的差异; B: 下画线部分 表示 GhMYB0的R2和R3保守结构域。Fig. 2 Alignment of the GhMYB0 with Gossypium raimondii and other species by ClustalX2 programA: gray parts indicate the different domains from Gossypium raimondii; B: underlined letters indicate R2 and R3 conserved domain of MYB transcription factor.

图3

Fig. 3

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图3 GhMYB0 系统进化树和基因组内含子位置图中“●”代表本研究中的 GhMYB0。“●” stands for GhMYB0.Fig. 3 Phytogenic tree of GhMYB0 and intron site of GhMYB0

利用ProtParam分析显示, GhMYB0的理论分子量为32.269 kD, 理论等电点为9.22, 平均亲水系数(grand average of hydropathicity, GRAVY)为-0.974。通过蛋白质亚细胞定位PSORT工具预测, GhMYB0蛋白被定位于细胞核, 用TargetP、SingleP、PredictNLS等进行定位信号分析, 综合结果表明 GhMYB0蛋白是核蛋白, 不具有信号肽或者定位信号。PROSITE分析结果显示GhMYB0含有MYB型的螺旋-转角-螺旋DNA结合域(Myb-type HTH DNA-binding domain profile)。

对GhMYB0基因亚细胞定位融合载体用基因枪轰击法转入洋葱表皮细胞, 用pBI121表达载体作为对照。经过培养后, 在激光共聚焦显微镜下观察, 显示对照GFP蛋白可以在细胞膜和细胞核内见到比较均一的明亮的绿色荧光(图4-A, B, C), 而pBI121-GhMYB0融合蛋白则位于细胞核中(图4-D, E, F), 更进一步说明GhMYB0蛋白是核定位的转录因子。

图4

Fig. 4

Figure Option ViewDownloadNew Window

图4 GhMYB0蛋白亚细胞定位GFP: 以暗场(A)、明场(B)和暗场、明场叠加(C)观察pBI121-GFP载体在洋葱表皮细胞中的瞬时表达。GhMYB0:GFP: 以暗场(D)、明场(E)和暗场、明场叠加(F)观察pBI121-GhMYB0:GFP融合表达载体在洋葱表皮细胞中的瞬时表达。Fig. 4 Subcellular localization of GhMYB0 proteinGFP: images of green fluorescence GFP of pBI121 vector in onion epidermal cells under dark-field (A), bright-field (B) and overlapped field (C). GhMYB0:GFP: images of green fluorescence GFP of pBI121-GhMYB0:GFP vector in onion epidermal cells under dark-field (D), bright-field (E), and overlapped field (F).

qRT-PCR分析表明, GhMYB0在整个发育过程中表达趋势基本一致, 并且表达量在不同时期均以徐州142野生型(WT)明显高于其突变体( fl)。 GhMYB0在徐州142开花当天(0 DPA)开始高调表达, 开花后20 DPA达到最大, 初步推测该基因可能在棉花纤维的起始和伸长阶段皆发挥一定的作用(图5-A), 该基因在花中表达最高, 在胚珠中其次(图5-B)。

图5

Fig. 5

Figure Option ViewDownloadNew Window

图5 GhMYB0表达的qRT-PCR分析DPA: 开花后天数; WT: 野生型徐州142; fl: 徐州142无绒无絮突变体。-3、-1、0、1、3、5分别代表-3、-1、0、1、3、5 DPA的胚珠和纤维组织; 10、15、20、25分别代表10、15、20、25 DPA纤维组织。Fig. 5 qRT-PCR analysis of GhMYB0 expressionDPA: days post anthesis; WT: wild type of Xuzhou 142; fl: the mutant of Xuzhou 142. -3, -1, 0, 1, 3, 5 indicate ovule and fibers at -3, -1, 0, 1, 3, 5 DPA respectively. 10, 15, 20, 25 indicate fibers at 10, 15, 20, 25 DPA respectively.

利用抗性筛选和PCR筛选, 共筛选出10个抗性转基因拟南芥株系, PCR结果显示10个转基因株系全部扩增出了与目的基因片段大小(843 bp)一致的特异性条带, 阴性对照(野生型拟南芥叶片)中没有扩增出此特异条带(图6); 分别提取T₃代野生型背景下2个转基因拟南芥株系(L2和L5)以及 gl-1突变体背景下3个转基因株系(Lb、Lc和Le)的总RNA, 反转录后进行qRT-PCR分析, 选拟南芥内参基因 AtTUB2作为平行反应, 引物GhMYB0-qF、GhMYB0-qR和AtTUB-qF、AtTUB-qR见表1。结果显示 GhMYB0在野生型拟南芥和 gl-1突变体中几乎不表达, 而在转基因株系中均有表达(图7)。综上说明, GhMYB0在这些转基因株系中正常表达, 并没有发生基因沉默。

图6

Fig. 6

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图6 转基因拟南芥阳性株PCR检测1: marker III; 2: 阴性对照; 22: 阳性对照; 3~21: 转基因株系。Fig. 6 PCR identification of transgenic Arabidopsislines1: marker III; 2: negative control; 22: positive control; 3-21: transgenic lines.

图7

Fig. 7

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图7 转 GhMYB0基因拟南芥阳性株qRT-PCR检测WT: 野生型拟南芥; gl-1: 拟南芥表皮毛缺失突变体; L2和L5: 2个T3代转野生型拟南芥株系; Lb、Lc、Le: 3个T3代转突变体拟南芥株系。Fig. 7 qRT-PCR detection of GhMYB0transgenic ArabidopsisWT: Columbia; gl-1: the mutant of Arabidopsis; L2 and L5: two T3 transgenic Arabidopsislines; Lb, Lc, Le: three transgenic T3 Arabidopsismutant lines.

为分析 GhMYB0转录因子基因的功能, 构建了35S::GhMYB0的拟南芥超表达载体, 并获得10个超表达后代纯系。与野生型相比, GhMYB0超表达拟南芥植株的表皮毛减少(图8)。利用SteREO Discovery.V8体视显微镜分别观察2个转基因株系(L2和L5)第3片真叶表皮毛, 每个株系3个重复, 统计分析表明, 超表达株系L2和L5皮毛密度分别为1.77个 mm^-2和3.26个 mm^-2, 分别比野生型低51.24%和10.19% (图9), 说明超表达株系中表皮毛密度降低。另外 GhMYB0能够恢复拟南芥表皮毛缺失突变体 gl-1的表型(图8)。可以看出过表达 GhMYB0对拟南芥表皮毛的生成有抑制作用, 与前人对 GL1和 GaMYB23( GL1同源基因)的研究结果相符。继续对T₃代35S::GhMYB0转基因拟南芥观察, 发现有一株系与野生型相比出现严重矮化的现象, 雄蕊明显短于野生型, 不能形成正常的果夹, 萼片上表皮毛数量与野生型相比明显增多(图10)。

图8

Fig. 8

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图8 GhMYB0转基因株系和野生型叶片表皮毛观察WT: 野生型拟南芥; gl-1: 拟南芥表皮毛缺失突变体。Fig. 8 Trichome of 35S::GhMYB0 transgenic lines and WTWT: Columbia; gl-1: the mutant of Arabidopsis.

图9

Fig. 9

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图9 GhMYB0转基因株系和野生型叶片表皮毛密度统计WT: 野生型拟南芥; gl-1: 拟南芥表皮毛缺失突变体; L2和L5: 转野生型拟南芥株系; a和A分别表示0.05和0.01水平上差异显著。Fig. 9 Trichome density of 35S::GhMYB0 transgenic lines and WTWT: Columbia; gl-1: the mutant of Arabidopsis; L2 and L5: the lines of transgenic Arabidopsisbacgruond wild type; “a” and “A” indicate singnificant difference at 0.05 and 0.01 levels, respectively.

图10

Fig. 10

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图10 GhMYB0转基因株系和野生型形态观察WT: 野生型拟南芥。WT: Columbia.Fig. 10 Morphologic observation of 35S::GhMYB0 transgenic line and WT