以中黄13×中黄20的100个BC2F2家系为作图群体, 构建了一张包含131个SSR分子标记的遗传连锁图谱, 图谱总长为2157.3 cM, 平均遗传距离为16.5 cM, 涵盖大豆的20个连锁群。利用气相色谱技术测定BC2F2、BC2F3和BC2F4回交群体的脂肪酸主要组分含量, 采用IciMapping 3.3完备区间作图法定位QTL。共检测到5种脂肪酸组分相关的QTL 26个, 与棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和亚麻酸相关的QTL分别为5、5、7、5和4个; 3个区间在不同年份被检测到与同一脂肪酸组分相关, sat_294~satt228连续3年被检测到与棕榈酸含量相关, sat_253~satt323和sat_292~satt397连续2年被检测到与油酸含量相关; 4个区间被检测到与2种脂肪酸组分相关, 其中sat_294~satt228与棕榈酸、油酸相关, satt308~sat_422与硬脂酸、亚油酸相关, sat_292~satt397与油酸、亚油酸相关, satt374~satt269与油酸、亚麻酸相关。
The soybean mapping population (100 BC2F2 lines) was developed from the cross Zhonghuang 13 × Zhonghuang 20. The linkage map contains 131 SSR markers covering a total distance of 2157.3 cM with an average of 16.5 cM. Five fatty acid components were measured by gas chromatography method in three years, and QTLs associated with these fatty acid components were analyzed using ICIM model in software IciMapping 3.3. A total of 26 QTLs were detected to be associated with the five fatty acid components, including five QTLs for palmitic acid, five QTLs for stearic acid, seven QTLs for oleic acid, five QTLs for linoleic acid and four QTLs for linolenic acid. Three marker intervals associated with the same fatty acid were detected repeatedly across years, including sat_294-satt228 for palmitic acid detected in three years and sat_253-satt323 and sat_292-satt397 for oleic acid detected in two years. Four intervals were found to be associated with two fatty acid components, i.e., sat_294-satt228 for palmitic and oleic acids, satt308-sat_422 for stearic and linoeic acids, sat_292-satt397 for oleic and linoeic acids, and satt374-satt269 for linoeic and linolenic acids.
大豆籽粒中脂肪主要是由甘油和脂肪酸组成的, 其中脂肪酸占脂肪总量的90%以上。大豆脂肪酸主要含有5种组分, 包括棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸与亚麻酸[ 1, 2], 其中棕榈酸和硬脂酸为饱和脂肪酸, 油酸、亚油酸和亚麻酸为不饱和脂肪酸。脂肪酸的组成决定了植物油的质量, 为了满足食用油和工业用大豆油的需求, 改良脂肪酸已经成为大豆育种的焦点[ 3, 4, 5]。
脂肪酸含量是受多基因控制的数量性状, 因此需要定位与脂肪酸含量相关的QTL以辅助大豆品质改良育种。QTL的定位群体主要有F2群体、回交(BC)群体、重组自交系(RIL)群体和加倍单倍体(DH)群体等[ 6], 定位方法主要有单标记作图[ 7]、区间作图[ 8]、复合区间作图[ 9]、完备区间作图[ 10, 11, 12]、多区间作图[ 13]等, 定位软件主要有WinQTL Cart、QTL network、IciMapping[ 14, 15]等。近年来, 国内外学者利用不同群体和不同方法定位到大量与脂肪酸含量相关的QTL[ 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25]。目前在http://soybase.org/上已公布的与脂肪酸含量相关的QTL共165个, 与棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和亚麻酸5种组分相关的QTL分别有34、19、36、35和41个。应用于大豆脂肪酸含量QTL的定位群体主要是F2群体和RIL群体, 而回交群体应用较少, 仅郑永战以BC1群体为材料, 利用复合区间作图和多区间作图方法, 定位到18个与脂肪酸含量相关的QTL[ 26]。
本研究利用实验室已构建的以优良品种中黄13为轮回亲本、中黄20为供体亲本的BC2回交群体, 结合表型数据和分子数据, 定位影响大豆脂肪酸主要组分含量的QTL, 从而为大豆脂肪酸分子标记辅助育种提供理论依据。
以我国综合性状优良的黄淮海主栽大豆品种中黄13为轮回亲本, 高脂肪含量品种中黄20为供体亲本, 通过1次杂交、2次回交得到BC2F1混合群体, 从中随机选取100株, 构成100个家系, 作为试验群体。
2011、2012和2013年在北京顺义试验基地分别夏播种植中黄13×中黄20回交群体BC2F2、BC2F3和BC2F4及亲本, 以家系为单位混收混播。采用随机区组设计, 单行区, 3次重复, 行长3 m, 行距0.45 m, 株距0.10 m, 四周设保护行, 田间管理同一般大田, 株行收获。
从每个家系每个重复随机选取30粒籽粒磨粉, 称取豆粉0.3 g置2 mL离心管中, 加入1.7 mL正己烷, 4℃过夜, 10 625 × g离心5 min, 吸取上清液加入300 μL甲醇钠溶液, 置摇床上振荡1 h, 10 625 × g离心5 min, 吸取上清液, 于GC上样检测。
参照于福宽等[ 27]的方法, 利用岛津气相色谱仪GC2010测定大豆中5种主要脂肪酸组分的含量, 包括棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和亚麻酸。根据大豆脂肪酸组分标准样品的保留时间, 判断未知样品的成分, 采用面积归一化法计算5种脂肪酸组分的百分比含量。每个重复测定3次, 取平均值作为该脂肪酸组分的含量。
BC2F3代植株出苗15~20 d后, 从每个家系选取15株, 采集幼嫩叶片, 等量混取。采用CTAB法提取叶片DNA, 用于基因型测定。参照http://soybase. org/网站上已定位到的与脂肪酸相关的QTL, 选择已知序列的SSR引物556对, 由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行引物多态性筛选和群体基因型鉴定。扩增产物与中黄13相同的带型记为“2”, 与中黄20相同的带型记为“0”, 杂合的带型记为“1”, 缺失的带型记为“-1”。
从表1可看出, 亲本中黄13和中黄20间5种脂肪酸含量均存在差异, 其中油酸的差异最大, 且中黄13只在油酸含量上低于中黄20, 其他4种组分均高于中黄20。不同年份两亲本的脂肪酸含量也有所不同, 说明脂肪酸含量受环境影响较大。群体内家系间5种脂肪酸变异丰富, 都存在明显的超亲分离, 说明该群体适合进行QTL定位。油酸的变异幅度最大, 3年的极差都在7%以上, 其中2012年达到了7.84%, 这可能是亲本间油酸差异较大导致后代发生了更广泛的分离变异。硬脂酸变异系数最大, 在2011年达到了6.64%, 这是因为硬脂酸本身含量低, 较小的变异值也会造成较高的变异系数。
方差分析表明, 大豆脂肪酸组分在家系、年份和家系与年份的互作间均存在极显著的差异(表2), 说明5种脂肪酸组分都是复杂的数量性状, 受基因和环境的共同影响。5种脂肪酸在家系间的变异为亚麻酸>油酸>硬脂酸>棕榈酸>亚油酸, 这与现有品种间变异程度的顺序是一致的。5种脂肪酸在年份间的变异为亚麻酸>亚油酸>油酸>硬脂酸>棕榈酸, 说明不饱和脂肪酸相较于饱和脂肪酸更易受环境的影响。
相关性分析(表3)表明, 脂肪酸组分之间都存在一定的相关, 棕榈酸和硬脂酸呈显著正相关, 即饱和脂肪酸2种组分的变化是一致的; 油酸和棕榈酸、硬脂酸均呈极显著的负相关, 间接说明不饱和脂肪酸是由饱和脂肪酸去饱和得到的; 油酸和亚麻酸、亚油酸也呈极显著负相关, 亚油酸和亚麻酸呈极显著的正相关, 这可能是因为不饱和脂肪酸是由同一种物质代谢得到的。油酸和亚油酸的相关系数最大, 为-0.92, 说明在育种中可以通过对油酸或亚油酸的选择, 从而达到对另一种成分的选择。此外, 从脂肪酸的相关上看, 选育适合食用和工业用的品种是可行的。
556对SSR引物利用两亲本进行多态性筛选, 其中165对引物具有多态性, 利用BC2F3代幼嫩叶片提取的DNA进行群体基因型鉴定, 其中131对引物表现出多态性。根据SSR测定结果分析, 后代具有轮回亲本中黄13基因型的平均频率为85.73%, 具有中黄20基因型的平均频率为6.15%。利用IciMapping 3.3软件的BIP功能构建了一张包含131个SSR标记的遗传连锁图谱, 图谱总长为2157.3 cM, 平均遗传距离为16.5 cM, 涵盖了大豆的20个连锁群(图1)。在同一连锁群上的标记数目从3~10不等, 可见标记分布并不均匀, 这与引物的选择有很大关系。图谱中标记间最小距离为1.36 cM, 最大距离为72.69 cM, 标记间距离较大的区间还应该加密。
利用新构建的遗传连锁图谱, 结合气相色谱仪测定的BC2F2、BC2F3、BC2F4群体5种主要脂肪酸含量, 采用IciMapping 3.3软件的MAP功能中的完备区间作图方法, 共定位到26个与5种脂肪酸组分相关的QTL (表4), 分布在13个不同的连锁群上, 其中以M连锁群上最多(图1)。
检测到5个与棕榈酸含量相关的QTL, 分布在A2、C1、L连锁群上。其中2011年检测到的 qPA-1、2012年检测到的 qPA-2和2013年检测到的 qPA-5均定位在A2连锁群标记sat_294~satt228间, 且均位于60 cM处, 说明三者是同一个QTL, 其表型贡献率达8.82%~11.55%, 这是唯一3年均被检测到与棕榈酸相关的区间(表5); 位于L连锁群标记satt613~ satt278区间的 qPA-3表型贡献率最大, 达12.34%。
检测到5个与硬脂酸相关的QTL, 分布在B2、K、M和O连锁群上。其中位于O连锁群上的 qSA-2和K连锁群的 qSA-3表型贡献率分别达21.26%和20.38%, 是2个相对主效的QTL; qSA-1和 qSA-5均被定位在M连锁群上, 但是2个QTL位置相距较远, 不是同一个QTL, 所以M连锁群上可能存在多个与硬脂酸合成和代谢相关的基因。
检测到7个与油酸相关的QTL, 分布在A2、D2、F、M和N连锁群上。其中 qOA-1和 qOA-4均被定位在M连锁群的sat_253~satt323区间, 表型贡献率分别为14.81%和17.64%, 位置仅相距1 cM, 基本可以认定是同一个QTL, 说明这是一个在供试群体中能够稳定遗传的QTL; 同样, 均定位在D2连锁群的sat_292~satt397区间的 qOA-2和 qOA-6很可能也是同一个QTL; 表型贡献率达到了9.57%的 qOA-5所在的区间sat_294~satt228, 与连续3年检测到与棕榈酸相关的区间相同, 但是位置相距19 cM, 可能不是同一个QTL; 位于F连锁群2侧标记分别为satt374和satt269的 qOA-7是检测到的7个QTL中表型贡献率最高的, 达到了23.31%。
检测到5个与亚油酸相关的QTL, 分布在C1、D2、E和M连锁群上。其中表型贡献率最高(15.69%)的 qLA-1被定位在D2连锁群上, 与油酸相关的 qOA-2和 qOA-6位于同一区间, 且与 qOA-6的位置相同, 说明控制油酸和亚油酸的基因可能是相同的, 这与2种组分间极显著相关是一致的; qLA-3与 qSA-5同样被定位到同一区间satt308~sat_422内, 但是由于在M连锁群的起始位置, 附近缺少相关标记, 所以难以判断是否为同一个QTL。
检测到4个与亚麻酸相关的QTL, 分布在C2、D1a、F和M连锁群上, 2012年没有检测到相关的QTL。其中表型贡献率高达20.75%的 qLNA-2, 与 qOA-7定位到同一个区间satt374~satt269内, 但是位置相距15 cM, 两者是否为同一个QTL还有待进一步验证。
脂肪酸组分在年份间差异极显著, 因此在进行脂肪酸相关研究时应该进行多年试验, 以获得更为准确的结果。棕榈酸含量受年份的影响最小, 这与Primomo等[ 30]的研究结果一致, 说明棕榈酸可能是5种脂肪酸中最稳定的。亚油酸和亚麻酸含量受年份影响较大, 而Hou等[ 31]和Zhe等[ 32]的研究表明, 亚油酸和亚麻酸受环境影响大, 可见年份和环境对这2种组分都有较大影响。在进行QTL定位时, 不同年份应作为不同性状, 以获得更多相对稳定的QTL。
棕榈酸和油酸呈极显著负相关, 这与吕景良等[ 2]和于福宽[ 20]的研究结果一致。油酸与亚油酸、亚麻酸含量呈显著负相关, 亚油酸与亚麻酸呈显著正相关, 这和张志永[ 33]、年海等[ 34]、陈霞[35]]和谢冬微等[ 36]的研究结果一致, 说明脂肪酸组分间的相关关系比较稳定, 可以通过对其中一种组分的选择, 间接达到选择其他组分的目的。
连续3年检测到区间sat_294~satt228与棕榈酸相关, 连续2年检测到sat_253~satt323和sat_292~ satt397与油酸相关, 这些可能是能够稳定遗传的QTL, 对于挖掘脂肪酸相关基因具有重要意义。在sat_294~satt228区间检测到与棕榈酸和油酸2种组分相关的QTL, 在satt308~sat_422间检测到与硬脂酸和亚油酸2种组分相关的QTL, 在sat_292~ satt397间检测到与油酸和亚油酸2种组分相关的QTL, 在satt374~satt269间检测到与油酸和亚麻酸2种组分相关的QTL, 这可能是因为区间范围较大, 区间内包含较多的相关基因, 也说明各个组分间存在相对稳定的相关关系。
本文在标记sat_294的附近多次检测到与棕榈酸和油酸相关的QTL, Bachlava等[ 37]也在多年多个环境检测到该标记与油酸相关, 说明这是一个能够稳定遗传的QTL, 受环境和遗传背景影响小。在satt184~satt179区间内检测到一个与亚麻酸相关的QTL, 该区间曾被Hyten等[ 38]利用Essex×Williams的RIL群体通过复合区间作图法定位到与脂肪相关, 亚麻酸是脂肪的重要组成部分, 两者的含量可能受同一基因的影响和调控, 此外该QTL在不同群体内被定位到, 说明可能是一个不受遗传背景影响的QTL或者这是一段相对保守的序列区间。
Qi等[ 39]在标记satt278、satt358和satt269附近检测到一些与脂肪相关的QTL, 而本文检测到3个标记分别与棕榈酸、硬脂酸和油酸相关, 虽然定位到了同一标记附近, 但都不是同一QTL, 说明在这些标记的附近存在一些与脂肪或脂肪酸相关的微效基因。标记satt045在本文中检测到与亚油酸含量相关, 但是在前人的研究中却检测到与棕榈酸和脂肪含量相关[ 40]。标记sat_132、satt560和satt308在本文中都是与硬脂酸含量相关, 但是在前人的研究中却显示sat_132与棕榈酸含量相关[ 41], satt308与蛋白质[ 42]、水溶性蛋白[ 43]和脂肪[ 44]相关, 而satt560则与亚麻酸[ 45]以及蛋白质[ 46]相关。可见, 脂肪酸各组分的合成与多种品质性状的合成相关, 说明脂肪酸的合成过程非常复杂, 调控网络相互交错, 进一步说明脂肪酸各组分都是由多个微效基因控制的数量性状。
此外, 本文还挖掘到一些从未报道过的与脂肪酸相关的QTL, 如 qOA-1 (sat_253~satt323)、 qOA-2 (sat_292~satt397)、 qLNA-2 (satt374~satt269)等, 这可能是本群体特有的QTL。这些QTL所在的区间在本研究中被多次定位到, 说明这是控制脂肪酸含量QTL的效应集中区域。从连锁图上可以看到, 连锁群M上定位到了多个不同的QTL, 下一步研究中应该对连锁群M进行标记加密, 以期获得更精确的QTL。
检测到26个与脂肪酸组分含量相关的QTL, 与棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和亚麻酸相关的QTL分别有5个、5个、7个、5个和4个。连续3年检测到sat_294~satt228与棕榈酸相关, 连续2年检测到sat_253~satt323和sat_292~satt397与油酸相关, 是相对稳定的QTL, 可应用于大豆脂肪酸分子标记辅助育种。检测到区间sat_294~satt228与棕榈酸、油酸相关, satt308~sat_422与硬脂酸、亚油酸相关, sat_292~satt397与油酸、亚油酸相关, satt374~satt269到与油酸、亚麻酸相关, 可能是相关基因分布的密集区。
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