2012年5月将甜高粱品种M81种植于中国农业科学院作物科学研究所北京昌平试验站, 2012年10月17日在该试验站以立式榨汁机榨汁后, 用蒸馏水冲洗茎秆渣5次至中性, 烘干后粉碎, 过40目筛备用。

纤维素酶由北京诺维信(中国)投资有限公司提供, 包括Novozymes NS 50013混合纤维素酶和Novozymes NS 50010β-葡萄糖苷酶。

1.2.1 常温+石灰 参照Chen等^{[ 18]}的方法, 将10% (w/v)甜高粱渣与1% (w/v) Ca(OH)₂混合在500 mL蒸馏水中, 混匀后常温放置, 每2 d摇匀一次。2周后处理完毕, 离心吸取上清液保存; 以中性蒸馏水洗涤残渣, 80℃烘箱烘干至恒重, 4℃保存。

1.2.2 高温高压+石灰 参照Choudhary等^{[ 19]}的方法, 将10% (w/v)甜高粱渣与1% (w/v)石灰混合在500 mL蒸馏水中, 混匀后以121℃高压蒸汽处理1 h, 待温度降至室温, 离心吸取上清液保存; 以中性蒸馏水洗涤残渣, 80℃烘箱烘干至恒重, 4℃保存。

1.2.3 微波+石灰 参照Heredia-Olea等的方法^{[ 20]}, 将10% (w/v)甜高粱渣与1% (w/v)石灰混合在500 mL蒸馏水中, 混匀后以微波炉(2450 MHz)处理4 min, 待温度冷却至室温, 离心吸取上清液保存; 以中性蒸馏水洗涤残渣, 80℃烘箱烘干至恒重, 4℃保存。

1.2.4 常温+NaOH 用500 mL、8% (w/v)的NaOH溶液按10% (w/v)的比例处理甜高粱茎秆渣, 混匀, 常温放置处理, 每2 d摇匀一次, 2周后处理完毕, 离心吸取上清液保存; 以中性蒸馏水洗涤残渣, 80℃烘箱干燥至恒重, 4℃保存。

1.2.5 对照(CK) 以清洗烘干后未经处理的甜高粱渣为对照。

酶解糖化甜高粱渣所用纤维素酶由诺维信(中国)投资有限公司提供, 混合纤维素酶Novozymes NS 50013的活性是70 FPU mL^-1, β-葡萄糖苷酶Novozymes NS 50010活性为250 CBU FPU mL^-1。一个纤维素酶的活性单位定义为反应体系在温度为50℃、pH为4.8条件下, 使反应混合物每分钟释放1 mg葡萄糖的纤维素酶量, 以FPU表示; 一个β-葡萄糖苷酶活性单位定义为反应体系在温度为50℃、pH为4.8条件下, 使反应混合物每分钟释放1 µmol对硝基苯酚的β-葡萄糖苷酶量, 以CBU表示。整个反应体系的水解作用发生在柠檬酸缓冲液中(50 mmol L^-1, pH 4.8), 甜高粱渣底物干物质(DM)添加量为5% (w/v), 混合纤维素酶NS 50013和β-葡萄糖苷酶NS 50010的添加量分别为20 FPU g^-1 DM和30 CBU g^-1 DM; 将摇床设定为50℃、150转 min^-1; 分别在12、24、36、48、60和72 h取样(1 mL), 10 000 × g离心吸取上清液、过滤, -20℃保存, 以高效液相色谱法(HPLC)测定糖含量。

依据范氏纤维素测定法^{[ 21]}及意大利VELP公司的粗纤维测定仪FIWE 6测定甜高粱渣木质纤维素组分纤维素、半纤维素和木质素, 各处理的测定均设计3个重复; 甜高粱渣酶解糖化后, 利用德国安捷伦高效液相色谱仪(Agilent 1260, ZORBAX SB-C18色谱柱, Germany)测定葡萄糖、木糖组分, 各测定均设计3个技术重复。

甜高粱秸秆渣木质纤维素各组分纤维素、半纤维素、木质素的回收率分别表示为 R_C、 R_HC、 R_L。

R_C=干物质回收率×纤维素所占比例

R_HC=干物质回收率×半纤维素所占比例

R_L=干物质回收率×木质素所占比例

甜高粱渣纤维素、半纤维素的直接水解率为 P_C 、P_HC, 纤维素^{[ 22]}、半纤维素的相对水解率为 T_C、 T_HC。

P_C=水解产物葡萄糖含量(g)/甜高粱渣中纤维素的含量(g)×1.11

P_HC=水解产物木糖含量(g)/甜高粱渣中半纤维素的含量(g)×1.14

T_C =水解产物葡萄糖含量(g)/甜高粱渣中纤维素的含量(g)×预处理甜高粱渣纤维素的回收率×1.11

T_HC=水解产物木糖含量(g)/甜高粱渣中半纤维素的含量(g)×预处理甜高粱渣半纤维素的回收率×1.14

其中1.11和1.14分别为葡聚糖和木聚糖转化为葡萄糖和木糖的转换系数。

使用Hitachi S570扫描电子显微镜(Hitachi High Technologies America, Pleasanton, CA), 扫描成像前, 放置甜高粱渣于烘箱中50℃过夜烘12~16 h, 将适量干燥的各处理甜高粱渣样品粘接在样品台上, 用离子溅射仪喷金, 使得样品能够进行电子传导并最终成像^{[ 19]}。

通过SPSS 17.0分析数据方差(One-way ANOVA)、检验差异显著性( P=0.05), 通过SigmaPlot 10.0绘制图表。

从表1看出, 通过范氏纤维素测定法测得对照甜高粱渣其纤维素、半纤维素、木质素及灰分的比例分别为39.03%、30.94%、4.64%和1.90%; 方差分析结果显示, 经过不同条件碱处理后, 各处理的甜高粱渣中纤维素组分所占比例与对照相比都有一定程度的提高( P<0.05), 半纤维素比例都有降低( P<0.05), 其中经过氢氧化钠常温处理后变化最为明显, 纤维素含量最高达到73.77%, 半纤维素含量降至9.14%; 这说明经过碱处理甜高粱秸秆渣的木质纤维素组成结构被改变, 且不同处理对于纤维素组分的纯化程度不同。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 各处理甜高粱渣木质纤维素的主要组分及干物质回收率 Table 1 Components of sweet sorghum bagasse and the recovery rate of the dry matter 预处理方式 Pretreatment 木质纤维素组分比例 Percentage of lignocellulose components (%) 干物质回收率 Recovery rate of DM 纤维素Cellulose 半纤维素Hemicellulose 木质素Lignin 灰分Ash 对照 CK 39.03±0.07 e 30.94±0.34 a 4.64±0.05 b 1.90±0.04 c 1.00 常温+石灰 Ca+RT 55.84±0.95 b 16.50±0.21 b 4.68±0.08 b 1.56±0.13 d 0.70 高温高压+石灰 Ca+AT 42.74±0.06 d 13.61±0.23 d 5.62±0.10 a 1.33±0.09 e 0.81 微波+石灰 Ca+MT 44.44±0.90 c 15.42±0.20 c 4.52±0.16 b 2.33±0.16 b 0.85 常温+NaOH Na+RT 73.77±1.46 a 9.14±0.17 e 2.04±0.12 c 4.58±0.08 a 0.49 Values followed by a different letter with in the same column are significantly different at P<0.05 using Duncan’s multiple range tests. RT: room temperature; MT: microwave treatment; AT: autoclave treatment; DM: dry matter. 同一列中标有不同小写字母的数据在0.05水平上差异显著。

表1 各处理甜高粱渣木质纤维素的主要组分及干物质回收率 Table 1 Components of sweet sorghum bagasse and the recovery rate of the dry matter

扫描电子显微镜观察(图1-A, B, C)表明, 没有处理的甜高粱渣(A)木质纤维素呈束状结晶缜密排列, 表层木质素紧密包裹纤维素组分, 这种结构将限制纤维素酶对纤维素组分的酶解作用; 高温高压石灰处理的样品(B)木质纤维素表层木质素结构被侵蚀严重, 但呈破碎状附着在纤维素表面, 没能够较好去除, 样品内部纤维素与半纤维素仍层层紧密排列, 半纤维素被部分溶解; 而甜高粱渣样品经NaOH常温长时间处理(C), 木质纤维素束状结构溶胀降解, 表层木质素成分被大量去除, 被包裹的纤维素组分显露, 纤维素网断裂且纤维素表面出现许多小孔, 说明半纤维素组分也被有效溶解, 这种组成结构对于纤维素酶的酶解是十分有利的。通过比较说明, 处理方法的作用强度、碱处理试剂的作用机制、处理时间的长短都对甜高粱渣处理效果有显著影响, 合理的物理化学方法的搭配和选取, 适用于不同的预处理目的, 也将对下一步的酶解糖化产生不同影响。

图1

Fig. 1

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	图1 以扫描电镜观察不同处理甜高粱渣的结构A: 没有经过预处理的甜高粱渣; B: 石灰(高温高压)预处理的甜高粱渣; C: 氢氧化钠预处理的甜高粱渣。Fig. 1 Observing the SSB’s lignocellulose structure by scanning electron microscopy (SEM)A: no pretreated SSB; B: SSB pretreated by lime under autoclave; C: SSB pretreated by NaOH at room temperature.

从图2看出, 随着水解时间的延长葡萄糖浓度逐渐增加。方差分析显示, 在所有预处理方法和对照处理中葡萄糖的浓度在36 h内都达到较高的稳定水平( P>0.05), 也说明在比较短的时间内, 已经达到了各处理的葡萄糖产量潜力。由图可知, 甜高粱渣纤维素酶酶解糖化过程中, 0~24 h内, 葡聚糖快速分解, 葡萄糖浓度快速升高; 24~36 h过程中, 葡萄糖浓度升高减缓; 48 h后葡萄糖浓度基本不变或者浓度升高已经很慢, 受各种条件限制葡聚糖酶解糖化作用缓慢。酶解糖化72 h后, 葡萄糖浓度为常温+ NaOH>高温高压+石灰>微波+石灰>常温+石灰>对照(CK); 经不同碱处理的甜高粱渣72 h时葡聚糖糖化产物浓度依次为41.179、20.952、18.259、15.112和9.847 mg mL^-1, 各碱处理分别达到对照组的4.2、2.1、1.9和1.5倍。酶解72 h后, 木聚糖糖化产物浓度为高温高压+石灰>微波+石灰>常温+石灰>常温+NaOH>对照(CK), 分别为9.236、9.041、5.727、4.409和1.848 mg mL^-1; 各碱处理分别达到对照的5.0、4.9、3.1和2.4倍。

图2

Fig. 2

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	图2 各处理甜高粱渣酶解糖化过程葡萄糖、木糖浓度的变化缩写同表1。Abbreviations are the same as given in Table 1.Fig. 2 Changes of glucose and xylose concentrations in the SSB enzymatic hydrolysis process

通过计算各处理的甜高粱渣的固形物剩余量及各处理甜高粱渣木质纤维素组分所占比例, 可以得出不同碱处理条件下, 甜高粱渣各组分的回收率(图3)。结果表明用石灰(氢氧化钙)处理, 可以去除一部分半纤维素(60%左右), 但对木质素的去除效果不好(都小于30%); 氢氧化钠可以有效地溶解去除半纤维素和木质素, 且纤维素的损耗小于10%。

如图4-A所示, 未经碱处理的甜高粱渣纤维素和半纤维素经过酶解糖化后, 其直接转化率分别为45.42%和10.51%, 也就是说, 甜高粱渣自身木质纤维素组分紧密的组合有效地阻碍了纤维素酶对纤维素组分的降解; 经过不同方法的碱处理纤维素和半纤维素的相对转化率都有所提高, 其中纤维素直接转化效率为常温+NaOH>高温高压+石灰>微波+石灰>常温+石灰>对照(CK), 其中氢氧化钠常温下长时间处理的甜高粱渣, 其纤维素转化率达到100%, 完全水解; 半纤维素的直接转化率为高温高压+石灰=微波+石灰>常温+NaOH>常温+石灰>对照(CK), 其中高温高压和微波条件下石灰处理的半纤维素转化率都达到100%, 半纤维素水解完全; NaOH处理的甜高粱渣半纤维素较前两者低, 还有可能是因为半纤维素分解生成了较多的糖醛等物质, 木糖得率不高。图4-B显示了各处理甜高粱渣纤维素组分的相对转化率, 纤维素相对转化率同直接转化率排序相同, 而半纤维素的相对转化率为高温高压+石灰=微波+石灰>常温+石灰>常温+NaOH>对照(CK), 说明NaOH处理的甜高粱渣半纤维素损耗较多, 综合利用率较低。

图3

Fig. 3

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	图3 各处理甜高粱渣木质纤维素组分的回收率Fig. 3 Recovery rate of SSB’s components under different treatments

图4

Fig. 4

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	图4 各处理甜高粱渣纤维素、半纤维素的相对转化率与真实转化率A: 为直接转化率; B: 为相对转化率。Fig. 4 The direct and relative conversion rate of cellulose and hemicelluloseA: direct conversion rate; B: relative conversion rate.