所用的茶树品种为特早生国家级茶树品种龙井43, 种植于中国农业科学院茶叶研究所国家种质杭州茶树圃。参照已报道的茶树胁迫处理^{[ 19, 20, 21]}及本实验室前期试验结果^{[ 22]}, 从日光温室中选取生长正常且长势相近的3年生盆栽茶树若干盆, 分别在低温(4℃)、ABA (100 μmol L^-1)和NaCl (250 mmol L^-1)胁迫下试验。

SMART RACE cDNA Amplication Kit和Advantage Polymerase Mix购于Clontech公司(Mountain View, CA, USA); SYBR Premix Ex Taq II (Perfect Real Time)、DNA Marker、TA Cloning Kit PCR2.1 Vector、大肠杆菌DH5α感受态细胞和 Taq聚合酶为TaKaRa公司产品(大连); DNase I Digestion of RNA Preparation、First-Strand cDNA Synthesis购自Invitrogen公司(Carlsbad, USA); 琼脂糖凝胶回收试剂盒购自Axygen公司(California, USA); RNA提取试剂盒购自天根公司(Tiangen, 北京)。脱落酸(ABA)购于SIGMA公司, NaCl、无水乙醇等为国产分析纯试剂。由上海华津生物技术公司合成引物并测序。

参照离心柱型植物总RNA快速提取试剂盒说明书提取茶树叶片总RNA。检测RNA浓度和完整性后于-80℃保存备用。用1 μg总RNA为模板, 参照SMART RACE cDNA Synthesis Kit的操作步骤合成5′和3′的cDNA, 用于RACE扩增, 以及反转录PCR (RT-PCR)扩增基因的全长开放阅读框(ORF)和亚细胞定位载体构建的PCR扩增; 以5 μg总RNA为模板, 按照DNase I Digestion of RNA Preparation和First-Strand cDNA Synthesis试剂盒说明书合成cDNA, 稀释40倍后作实时荧光定量PCR (qRT-PCR)模板, 进行qRT-PCR检测。

1.3.1 茶树 CsbZIP1基因的克隆 根据本实验室茶树冷驯化转录组测序结果(NCBI登录号为SRA061043), 经Blast比对筛选出与其他植物中报道的 bZIP基因高度同源的EST序列, 设计5′和3′-RACE特异引物5′GSP/3′GSP (表1)。参照SMART RACE cDNA Synthesis Kit的操作步骤进行茶树 bZIP基因的PCR反应, 反应条件为94℃预变性4 min; 94℃变性30 s, 68℃退火30 s, 72℃延伸2 min, 30个循环; 72℃延伸10 min。产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测, 将目的条带回收纯化, 连接到PCR2.1载体, 转化大肠杆菌DH5α, 蓝白斑筛选阳性菌落, 挑取10个白色单菌落进行菌落PCR检测, 挑选3~4个阳性菌落送上海华津生物公司测序。经去载体、拼接, 得到茶树 bZIP基因的5′和3′端序列, 与中间序列拼接, 得到 bZIP基因的全长cDNA序列。在ORF上、下游区域设计RT-PCR特异引物RT-F/RT-R (表1), 以PCR扩增验证ORF序列。反应条件为94℃ 4 min; 94℃ 30 s, 58℃ 30 s, 72℃ 1 min, 35个循环。PCR产物经回收、连接、转化、测序和拼接后, 获得完整的茶树 bZIP基因全长cDNA序列。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 试验引物及其序列 Table 1 Sequence of primers in this study 引物名称 Primer 序列 Sequence of primers (5′→3′) 引物名称 Primer 序列 Sequence of primers (5′→3′) 5′GSP TGGAAACCTTGTCTTGAGTTGCGG 3′GSP TCGTGAAGCGGTTCGCAAGTATC RT-F CCTCTCATTCACACACTTGTCGTC RT-R CCAATCTCCCCTTCAATCCTCCC CsbZIP1-qRT-F CCTCGGATGTCCACAAGCAA CsbZIP1-qRT-R CGTGAAGCGGTTCGCAAGTA CsbZIP1-GFP-F AATAGGTACCATGGACGATGGGGAGATTGAT CsbZIP1-GFP-R ATAACTCGAGCCTTGCTGCACGAGTCCCTCCT 18S-F TCTCAACCATAAACGATGCCGACCAG 18S-R TTTCAGCCTTGCGACCATACTCCC

表1 试验引物及其序列 Table 1 Sequence of primers in this study

1.3.2 CsbZIP1生物信息学分析 利用NCBI的BlastX和BlastP进行核苷酸和氨基酸序列比对分析; 用DNAStar 软件查询开放阅读框; 用ProtParam预测蛋白质分子量和理论等电点; 用SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)进行保守域分析; 用DNAMAN进行多序列氨基酸比对; 用MEGA5.0软件中的邻近相连法构建系统进化树; 用NetPhos 2.0 Serve (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)预测蛋白质磷酸化位点; 用SWISS-MODEL (http://swissmodel.expasy.org/workspace/)和PyMol软件预测蛋白质三级结构; 用WoLF PSORT (http://wolfpsort.org/)进行亚细胞定位预测。

1.4.1 载体的构建 以CsbZIP1-GFP-F/CsbZIP1-GFP- R为引物, 扩增 CsbZIP1基因, 纯化扩增产物, 用 Kpn I和 Xho I酶切, 回收酶切产物; 再用 Kpn I和 Xho I对P2GWF7质粒进行酶切反应; 最后, 把酶切回收的PCR产物和质粒酶切片段连接, 构建载体p2GWF7-CsbZIP1, 转入DH5α, 菌液PCR、酶切筛选阳性克隆, 并对阳性克隆进行测序验证。

1.4.2 P2GWF7-CsbZIP1转化洋葱表皮细胞 取 50 mg mL^-1金粉悬液50 μL于离心管, 依次加入5 μL质粒DNA (1 μg μL^-1), 50 μL CaCl₂(2.5 mol L^-1)和20 μL亚精胺(0.1 mol L^-1)(每加完一样可振荡3 s), 静置10 min; 然后振荡1 min, 冰上10 min, 9400× g离心10 s, 弃上清; 再用80 μL无水乙醇, 洗涤沉淀一次; 重新悬浮沉淀于10 μL无水乙醇中; 每次用10 μL滴于微粒载膜中央, 平铺, 晾至完全干燥, 待用。取新鲜洋葱, 用无菌刀片切取肉质较厚的3~4层鳞茎, 用镊子撕出表皮平铺于MS培养基上, 25℃预培养4 h。选用1100 psi的压力膜, 将10 μL金粉DNA混合物滴在压力膜中央, 将洋葱表皮放在琼脂糖培养基上, 采用PDS1000/He型基因枪(Bio-Rad)轰击。将轰击后的洋葱表皮细胞25℃暗培养16 h后制片, 于激光共聚焦显微镜下观察并照相。

以茶树 18S基因作为内参基因, 参照SYBR Premix Ex Taq II (Perfect real-time)的操作说明书对 CsbZIP1基因的表达进行荧光定量PCR分析, PCR体系为SYBR Premix Ex Taq25 μL、10 μmol L^-1上下游引物各1 μL、ROX Dye II 1 μL、cDNA 2 μL, 加水至终体积50 μL。反应在ABI PRISM 7500实时定量PCR仪上进行, 程序为95℃ 15 s, 94℃ 5 s, 60℃ 34 s, 40个循环。反应结束后分析荧光值变化曲线和熔解曲线, 采用2^-ΔΔCT法分析结果^{[ 23]}, 每个样品3次重复。

2.1.1 CsbZIP1全长cDNA克隆与序列分析 根据中间EST片段序列, 设计5′和3′-RACE特异引物, 分别扩增出928 bp和410 bp的序列(图1), 用SeqMan软件把3段序列拼接初步得到cDNA全长, 再查找其开放阅读框(ORF), BlastX比对其ORF, 在ORF上下游设计引物进行RT-PCR扩增验证, 扩增得到813 bp的序列(图1)。最终获得该基因cDNA全长序列1515 bp, 包含813 bp的完整ORF, 编码270个氨基酸, 理论等电点为7.175, 推测分子量29.484 kD。NCBI比对分析结果表明, 它含有bZIP家族典型的BRLZ结构域, 属于B_-zip1家族; 与可可( Theobroma cacao) EOX97663.1、大豆( Glycine max) NP_-001235033.1的氨基酸相似性分别为68%和66%。CsbZIP1蛋白与其他植物bZIP氨基酸序列进行多序列比对表明, 在N端具有保守的bZIP碱性结构域和亮氨酸拉链(图2)。对CsbZIP1氨基酸序列分析, 显示氨基酸序列

图1

Fig. 1

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	图1 CsbZIP1的RACE及RT-PCR电泳结果Fig. 1 Electrophoresis results of RACE fragments and RT-PCR fragments of CsbZIP1

图2

Fig. 2

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	图2 CsbZIP1与其他植物同源bZIP的氨基酸多序列比对黑色画线标记为bZIP家族保守的N-x7-R/K-x9-L-x6-L-x6-L序列。Fig. 2 Multiple amino acid alignment of CsbZIP1 with other species homologous bZIPConserved sequence N-x7-R/K-x9-L-x6-L-x6-L of bZIP family is underlined.

第95~127位为典型的bZIP碱性结构域和亮氨酸拉链结构域(图3)。因此, 该基因属于bZIP转录因子家族, 并命名为 CsbZIP1 (GenBank登录号为JX050148.1)。

图3

Fig. 3

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	图3 CsbZIP1的cDNA核苷酸序列及预测氨基酸序列图中阴影部分为碱性结构域(N-x7-R/K-x9); 下画线部分为亮氨酸拉链结构域(L-x6-L-x6-L), 其中黑色反白标识为亮氨酸(Leucine)。Fig. 3 Nucleotide and putative amino acid sequence of CsbZIP1The shaded parts are basic region (N-x7-R/K-x9); underlined parts are leucine zipper motif; and black parts are leucine.

2.1.2 CsbZIP1蛋白与拟南芥bZIP蛋白的系统进化树分析 根据Jakoby等^{[ 4]}对拟南芥bZIP亚家族的分类, 从每个亚家族挑选取2~3个拟南芥 bZIP基因, 采用MEGA 5.0邻近相连法对CsbZIP1与21个拟南芥bZIP氨基酸序列比对, 并构建系统进化树(图4), 结果显示CsbZIP1与拟南芥Group F聚为一类, 从理论上推测CsbZIP1属于bZIP转录因子的F亚家族。

图4

Fig. 4

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	图4 CsbZIP1蛋白与21个拟南芥bZIP转录因子蛋白的进化树分析Fig. 4 Phylogenetic tree analysis of CsbZIP1 protein with 21 Arabidopsis bZIP proteins

2.1.3 CsbZIP1编码蛋白的磷酸化位点预测 用NetPhos 2.0 Serve预测CsbZIP1蛋白磷酸化位点(图5)表明, 含有丝氨酸(Serine)、苏氨酸(Threonine)和酪氨酸(Tyrosine)的多个磷酸化位点中以丝氨酸位点最多, 有13个, 苏氨酸和酪氨酸位点各1个。由此推测磷酸化作用可能与CsbZIP1蛋白的活性调控有关。

图5

Fig. 5

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	图5 CsbZIP1蛋白磷酸化位点预测Fig. 5 Phosphorylation site prediction of CsbZIP1 protein

2.1.4 CsbZIP1编码蛋白的三级结构预测 用SWISS- MODEL预测CsbZIP1蛋白的三级结构, 经过PyMol软件模拟分析, 得到CsbZIP1蛋白的三维结构图(图6)。结果显示与Jakoby等^{[ 4]}获得的拟南芥bZIP蛋白的三级结构模型图相似, 均含有bZIP转录因子典型的α-螺旋和亮氨酸拉链结构, 进一步证实获得的 CsbZIP1属于bZIP转录因子家族。

图6

Fig. 6

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	图6 CsbZIP1蛋白三维结构图Fig. 6 3-D structure of CsbZIP1 protein

用WoLF PSORT软件进行亚细胞定位预测显示, CsbZIP1主要定位在细胞核内。洋葱表皮亚细胞定位试验的结果也显示CsbZIP1融合蛋白位主要定位于细胞核内(图7), 但是细胞内其他部位也检测到微弱信号。bZIP定位在细胞核内与它的功能密切相关。

图7

Fig. 7

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	图7 CsbZIP1亚细胞定位Fig. 7 Subcellular localization of CsbZIP1

荧光定量PCR结果表明(图8), 4℃低温处理能够诱导 CsbZIP1的表达, 且随着处理时间的延长, 表达量在处理 8 h最大, 达到11.59, 24 h降低为6.72。100 μmol L^-1ABA 处理后 CsbZIP1的表达被抑制, 2 h的相对表达量最低只有0.2, 但随着胁迫的继续, 表达量逐渐上升, 在24 h时表达量升高到0.90, 但没有超过0 h的表达量。250 mmol L^-1NaCl处理后, CsbZIP1的表达量呈先升高后降低的趋势, 处理4 h表达被诱导, 表达量达3.86, 随着处理时间延长至24 h, 表达量降低为1.21。 CsbZIP1在低温、高盐和ABA胁迫下均响应, 低温能够显著诱导其表达, NaCl短时间内也能上调其表达, ABA则能迅速抑制其表达。

图8

Fig. 8

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	图8 逆境胁迫处理下 CsbZIP1的相对表达量Fig. 8 Relative expression of CsbZIP1under stress treatments