2012年5月于江苏省徐州市(33° 43'~34° 58'N, 116° 22'~118° 40'E)田间采集的受赤霉病侵染及未被侵染的小麦, 品种为济麦22、矮抗58和洛麦24。根据小麦籽粒表皮皱缩及变色情况将染病麦穗与未染病麦穗分开, 分别脱粒。经检测, 染病麦粒中ZEN的含量为2089.83 μ g kg^-1, 未染病麦粒中ZEN未被检出。将染病麦粒与未染病麦粒进行梯度混合, 形成5个ZEN污染水平的小麦样品, ZEN含量分别为28.78、81.91、123.33、1394.09和2089.83 μ g kg^-1, 每个水平设置3次重复。

试剂甲醇、乙腈均为色谱纯, 购自美国Fisher公司; 乙酸铵购自国药集团化学试剂有限公司; ZEN标准品购自国家标物中心。

主要仪器包括超高效液相色谱-串联四级杆质谱(UPLC-XEVO TQ, 美国Waters公司)、布勒实验磨(MLU 202, 瑞士Bü hler公司)、醒发箱(JXFD 12, 北京东方孚德发展中心)、烤炉(JKLZ 4, 北京东方孚德发展中心)、制面机(OHTAKE-150, 日本Ohtake Mfg有限公司)、小麦水分仪(美国Dickey-john公司)、MILLI-Q纯水机(美国Millipore公司)、氮吹仪(HSC-24B, 天津市恒奥科技公司)、均质器(T18, 德国IKA独资)、涡旋混匀器、天平。

1.2.1 磨粉 按照我国农业部颁布的NY/T 1094.1-2006至1094.5-2006小麦实验制粉方法进行小麦制粉。小麦样品经清理后得到1.0 kg净麦, 测定小麦水分含量, 计算润麦所需的水分, 将小麦倒入塑料桶中, 按计算结果加水, 混匀20 min; 随后将小麦转移至自封袋, 密闭袋口, 放置16~24 h, 使水分含量达到16.5%左右。以布勒实验磨磨粉。磨粉间温度保持在23~25℃, 相对湿度40%~50%。每个样品磨粉之前将磨空转30 min, 并清理, 以避免样品间的交叉污染, 后将样品倒入磨料斗中, 开动实验磨, 分别收集粗麸皮、细麸皮、皮磨粉1B、2B、3B和心磨粉1M、2M、3M共8种组分, 最后将6种粉路面粉混匀, 得到统粉, 用于制作各种面制食品。分别检测粗麸皮、细麸皮及统粉中的ZEN含量。

1.2.2 馒头制作 按照粮食行业标准LS/T 3204-1993馒头用小麦粉方法制作馒头。称取100 g小麦粉, 加入含有1 g干酵母的温水(38℃)约48 mL, 用玻璃棒或筷子混合成面团后, 手工揉3 min, 于38℃恒温箱中醒发1 h, 取出再揉3 min成型, 在室温放置15 min, 放入已煮沸并垫有纱布的铝蒸锅屉上蒸20 min (冒气时开始计时), 取出并盖上干纱布冷却40~60 min。分别在和面后、面团发酵后和蒸制后取样, 并检测ZEN的含量。取得的样品于检测前置-20° C条件下保存, 下同。

1.2.3 面包制作 按照国家标准GB/T 14611- 2008粮油检验-面包烘焙品质试验-直接发酵法制作面包。第一步, 称样。称取3.0 g盐, 12.0 g糖, 放入烧杯, 加入适量蒸馏水搅拌溶解, 制成盐-糖溶液, 称取200 g面粉, 即发干酵母3.6 g, 起酥油6 g。第二步, 和面。量取盐-糖溶液, 放入和面缸中, 再放入面粉及其他配料, 启动搅拌机, 使面团达到面筋充分扩展状态。第三步, 发酵和揉压。将调制好的面团从和面缸中取出, 分成两等份, 用手搓圆面团, 使其光面向上放在稍涂有油的发酵钵中, 置醒发箱中发酵90 min, 发酵时间从开始和面时计起, 当面团发酵进行到55 min和80 min时, 分别在压片机面辊间距0.6 cm处滚压面团一次, 辊压后再将面片折成3层或对折2次折缝向下放入发酵钵, 重新放回醒发箱。第四步, 成型。取出发酵好的面团, 将面团轻轻揉光并适当拉长, 用压片机将面团压2次, 成长片, 轧距分别为0.7 cm和0.5 cm, 使用三辊成型机成型, 将面团接缝向下, 放在事先涂有油的面包听中。第五步, 醒发。面包成型装听后, 送入醒发箱醒发, 醒发箱温度为30℃± 1℃, 相对湿度为85%~90%, 醒发时间为45 min。第六步, 烘烤。醒发结束立即入炉, 215℃烘烤20 min。分别在和面后、面团发酵后、醒发后和烘烤后取样、检测。

1.2.4 面条制作 按照粮食行业标准LS/T 3202- 1993面条用小麦粉方法加工面条。取300 g面粉, 加入温水(约30℃), 用和面机慢速(自转61转 min^-1, 公转47转 min^-1)搅拌5 min, 再用中速(自转126转 min^-1, 公转88转 min^-1)搅拌2 min, 取出料坯放在容器中在室温下静置20 min, 用小型电动组合面条机在压辊间距2 mm处压片→ 合片→ 合片, 然后, 把压辊轧距调至3.5 mm; 从3.5 mm开始, 将面片逐渐压薄至1.0 mm, 共压片6道, 最后在1.0 mm处压片并切成2.0 mm宽的细长面条束。量取500 mL自来水于铝锅中, 在电炉上煮沸, 称取50 g面条样品, 放入锅内, 煮至面条芯的白色生粉刚刚消失, 立即将面条捞出, 以流动的自来水冲淋约10 s。分别在和面后、面团熟化后、轧面后及煮制后取样, 另取煮面条的水, 测定ZEN的含量。

称取10 g样品(精确至0.01 g)于150 mL锥形瓶中, 加入80%乙腈-水溶液50 mL, 以均质器高速均质3 min后过滤, 滤液过MycoSep 226多功能净化柱(美国Romer实验室), 取4 mL净化液于50℃水浴中氮吹至近干, 以甲醇-10 mmol L^-1乙酸铵(1:1, v:v)溶解, 混匀并定容至1 mL, 过0.22 μ m MICRO PES聚醚砜膜(德国Membrana公司), 待测。取10 mL液体样品, 加入80%乙腈-水溶液40 mL, 振荡提取30 min, 过多功能净化柱, 后续处理与固体样品前处理过程相同。

参考孙娟等^[11]的方法检测样品中ZEN, 液相色谱的色谱柱为ACQUITY BEH C₁₈柱(50 mm × 2.1 mm, 粒径1.7 μ m), 流速为300 μ L min^-1, 柱温为26℃, 进样体积为5 μ L。

质谱分析中应用电喷雾离子源(ESI⁺); 多反应监测(MRM)模式采集; 毛细管电压2.50 kV; 离子源温度110℃, 去溶剂气流量800 L h^-1; 去溶剂气温度450℃。流动相A为甲醇, 流动相B为10 mmol L^-1乙酸铵溶液(0.75 g乙酸铵溶于1000 mL水中)。梯度洗脱程序为0~5.5 min, 20%~85% A; 5.5~5.8 min, 85%~100% A; 5.8~6.0 min, 100%~20% A; 6.0 min, 20% A, 平衡2 min。ZEN采集参数包括母离子(m/z) 319.05, 定量子离子283.8, 定性子离子187.3, 保留时间4.73 min。

样品中真菌毒素含量的计算公式为$W= c· V· F/m$。式中, W为待测ZEN含量(μ g kg^-1), c为试样溶液中被测组分溶液浓度(μ g L^-1), V为净化后最终定容体积(mL), m为试样质量(g), F为稀释倍数。

采用Microsoft Excel 2007进行数据的录入、计算和作图。

与小麦籽粒相比, 磨粉后得到的3种组分中, 粗麸皮和细麸皮的ZEN含量均显著升高(P< 0.05)。粗麸皮中ZEN的含量为籽粒的1.9~3.4倍, 平均2.4倍; 细麸皮中ZEN的含量为籽粒的1.2~3.4倍, 平均2.1倍(图1)。除样品1外, 各样品粗麸皮中ZEN的含量均显著高于细麸皮中ZEN的含量(P< 0.05); 小麦粉中ZEN的含量比小麦籽粒降低45%~89%, 平均降低74%, 差异显著(P< 0.05)。试验结果表明, 磨粉过程能够将小麦籽粒中的胚乳和毒素含量较高的籽粒表层分离开来, 使毒素发生重新分配, 即降低小麦粉中毒素的含量, 使其集中于麸皮等副产物中。

和面过程使各小麦粉样品中ZEN的含量平均升高近70%, 且差异均达到显著水平(P< 0.05); 面团经发酵后, ZEN的含量显著降低(P< 0.05), 平均降低76%; 馒头中ZEN的含量达到小麦粉的1.8~3.8倍, 平均增高1.8倍; 蒸制后馒头中ZEN的含量比发酵后的面团平均增高2.2倍(图2)。由此可见, 馒头加工过程使小麦粉中ZEN的含量显著升高, 升高的趋势由和面过程开始, 面团发酵过程中降低, 在蒸制过程后显著升高。

图1

Fig. 1

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	图1 小麦各磨粉组分中ZEN的含量 误差线表示3个样品重复的标准差。Fig. 1 ZEN concentrations in different wheat milling fractions The error bar shows the standard deviation of three replicates of a sample.

图2

Fig. 2

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	图2 馒头加工过程中ZEN的含量变化 误差线表示3个样品重复的标准差。 The error bar shows the standard deviation of three replicates of a sample.Fig. 2 Changes of ZEN concentrations during Chinese steamed bread processing

和面过程使小麦粉中ZEN的含量平均升高70%以上; 面团发酵过程显著增加了ZEN的含量(P< 0.05); 面团醒发过程对ZEN含量的影响因样品而异, 样品1、样品3、样品5中ZEN的含量显著升高, 样品4中ZEN含量降低, 样品2中ZEN的含量无显著变化; 发酵-醒发阶段, 面团中ZEN的含量升高约40%。面包中ZEN含量比面粉中平均增高近1倍, 差异显著(P< 0.05); 焙烤过程使面团中ZEN的含量平均降低20%以上(图3)。说明面包加工过程使ZEN含量增高, 和面至面团发酵-醒发过程中, 面团中ZEN含量基本呈持续升高的趋势, 而在焙烤过程中ZEN含量降低。

图3

Fig. 3

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	图3 面包加工过程中ZEN的含量变化 误差线表示3个样品重复的标准差。Fig. 3 Changes of ZEN concentrations during bread processing The error bar shows the standard deviation of three replicates of a sample.

和面过程使小麦粉中ZEN的含量平均升高约20% (样品1除外), 差异显著(P< 0.05); 经过熟化后, 面团中ZEN含量降低约30%; 面团轧制成生面条后, ZEN含量平均升高70%。生面条中ZEN的含量比小麦粉中平均增长36%, 而熟面条中ZEN含量则平均降低31%, 最高的降低近50%, 同时煮面条的水中检测到较低含量的ZEN (图4)。由此可见, 面条加工过程使小麦粉中的ZEN含量升高, 而煮制过程显著降低了面条中的毒素含量; 和面及轧面过程均使ZEN的含量增高。

图4

Fig. 4

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	图4 面条加工过程中ZEN的含量变化 误差线表示3个样品重复的标准差。Fig. 4 Changes of ZEN concentrations during noodle processing The error bar shows the standard deviation of three replicates of a sample.

磨粉是小麦加工中的关键步骤, 收获后的小麦通过磨粉将种皮和胚乳分开获得麸皮和小麦粉。由于真菌对小麦的侵染是由表层开始逐渐向内蔓延的, 导致小麦籽粒表面比内部累积更多的毒素^{[12, 13, 14]}, 因此, 与小麦籽粒相比, 小麦粉中的毒素含量可降低30%~50%^{[15, 16, 17]}, 而麸皮中的毒素含量可达籽粒含量的2倍或2倍以上^[18]。本课题组也发现小麦经磨粉加工后, 粗麸皮中DON及脱氧雪腐镰刀菌烯醇-3-葡萄糖苷(deoxynivalenol-3-glucoside, D3G)的含量分别达小麦籽粒的1.2~2.2倍和2.9~4.4倍, 细麸皮中的毒素含量稍低于粗麸皮; 与小麦籽粒相比, 面粉中DON和D3G的含量分别降低79%~90%和23%~ 39%^[19]。尽管不同的研究采用的磨粉方法不尽相同, 但几乎所有的研究都报道毒素在小麦磨粉后获得的各组分中具有相似的分布趋势, 本研究小麦粉中ZEN含量比小麦籽粒平均降低70%以上, 粗麸皮和细麸皮中ZEN的含量达籽粒的2倍以上。

真菌毒素在食品加工过程中非常稳定^{[20, 21, 22, 23, 24]}, 因此常出现在终产品中。目前的研究主要集中于DON在面包、面条加工过程中的变化, 而对其他真菌毒素的研究较少, 馒头加工过程中毒素的变化也未有报道。关于面包加工过程中毒素的变化, 研究结果并不一致。Ncira等^[25]研究表明, 小麦面团经发酵和烘焙后DON的含量分别降低21.6%和28.9%; 而Scott等^[26]报道, 普通饼干和面包经过烘烤, DON分别减少35%和24%~71%, 但是埃及面包中的DON经烘烤后却没有减少。也有报道称, 焙烤后面包中DON的含量比混合面团升高40.8%, 并认为这是由隐蔽型真菌毒素(masked mycotoxins)引起的^[27]。隐蔽型真菌毒素是真菌毒素与一些极性较强的物质如糖、氨基酸、硫酸盐等结合形成的, 主要是与葡萄糖苷结合, D3G即是DON与葡萄糖苷结合形成的^[28]。我们也曾发现, 面粉经加工制成馒头和面包, 其DON含量比面粉增高约1倍, 而D3G含量显著降低, 推测可能是发酵过程中酵母产生的水解酶可作用于面粉中的D3G, 使其释放出DON, 导致DON含量升高^{[19, 29]}。在本研究中, 馒头、面包和生面条中ZEN的含量与小麦粉相比分别高近2倍、1倍和36%。据报道, ZEN可与葡萄糖结合形成玉米赤霉烯酮-14-葡萄糖苷(zearalenone-14-glucoside, Z14G) ^{[30, 31, 32]}。植物和真菌也能够将ZEN转化为玉米赤霉烯酮-14-硫酸盐(zearalenone-14-sulphate, Z14S) ^{[33, 34]}。此外, ZEN的生物转化也可能积累α -玉米赤霉烯醇(α -zearalenol, α -ZOL)和β -玉米赤霉烯醇(β -zearalenol, β -ZOL)等非结合型代谢物, 这些物质也能够与葡萄糖反应, 分别形成α -ZOLG和β -ZOLG^[35]。ZEN含量的升高是否由于存在ZEN与大分子物质结合形成的隐蔽型ZEN, 是何种隐蔽型ZEN, 还需要进一步研究。

在馒头、面包和面条加工过程中, 和面过程均使面粉中ZEN的含量显著升高; 轧制面条的过程中ZEN的含量升高约70%。我们在其他试验中发现, 面团轧制成面条后, 大多数样品中DON的含量升高, 而D3G的含量降低79%, 初步推断可能是D3G在机械加工过程中转化为DON。如果这种推断成立, 则表明机械加工对毒素的结构和含量有重要影响, 但其转化机制还需深入研究予以揭示。馒头和面包加工过程中, 面团经过发酵过程, 而面条加工只经过面团熟化过程。本试验中, 馒头面团和面条面团在分别经过发酵和熟化过程后, ZEN的含量分别降低约70%和30%; 面包面团中ZEN的含量在发酵-醒发阶段升高约40%。食品加工过程中的许多因素, 如食品基质、pH值、水分含量、加工温度、发酵食品中的成分(如酶类)等都会对毒素的结构及含量产生影响^{[36, 37]}。本试验中, 面团发酵/熟化阶段ZEN含量的不同变化可能与加工过程中使用的添加剂、发酵/熟化时间、发酵/熟化温度等有关。面包加工过程中使用了酵母、糖、盐和黄油等, 馒头加工中使用了酵母, 而面条加工中未使用任何添加剂; 面包的发酵/熟化时间要长于馒头和面条; 在发酵/熟化温度上, 馒头和面包要高于面条。此外, 和面过程中加入的水大部分只是吸附在面粉蛋白质胶粒表面, 呈游离状态, 面团熟化过程中, 面粉蛋白质充分吸水溶涨, 伸展开的蛋白质大分子相互交织在一起组成了网状结构, ZEN可能与糖、硫酸盐等络合于蛋白质网状结构中并发生结合, 导致检测到的ZEN含量降低。

关于面条加工过程中毒素含量的变化, 现有的研究均报道了相似的结果。据报道, DON的含量在加工成面条以及烹饪过程中降低^[38]。硬质小麦加工成意大利面后DON含量有所降低, 其中清理、磨粉、面条加工、烹饪等各环节分别占23%、63%、67%和80%, 小麦中DON的含量在加工成面团后降低至25%以下^[39]。面条加工过程中DON含量的降低是由于DON向水中发生了迁移^{[38, 39, 40]}。我们的另一项研究发现, 熟面条中DON和D3G的含量分别约为面粉的50%和20%^[29]。本研究中, 熟面条中ZEN的含量比小麦粉中降低30%左右, 推测是部分ZEN迁移至水中所致。

小麦粉中毒素的残留量与小麦品种及真菌对小麦籽粒的侵染程度有关^{[38, 39, 41, 42]}, 毒素含量降低的程度取决于污染程度^[39]。在人类密切关注食品卫生质量和安全的今天, 真菌毒素对小麦及其制品的污染已成为不可忽视的问题。如何有效地控制真菌毒素的产生, 在生产加工环节降低真菌毒素的含量, 建立完善的真菌毒素限量标准, 已成为当今农产品生产、食品加工和健康领域研究的热点。我国于2011年颁布的国家标准“ 食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量” (GB 2761-2011), 对小麦、小麦粉中ZEN的最高限量为60 μ g kg^-1。本研究结果表明, 加工过程对小麦制品中ZEN含量有显著影响, 因此上述国标最高限量存在一定的局限性。建议针对面粉和不同小麦粉加工制品提出不同的ZEN最高限量, 同时必须指出, 麸皮等副产物通常作为牲畜饲料而间接进入人类的食物链, 麸皮中较高的毒素含量可能对牲畜造成安全风险, 以至肉、奶等动物产品进入人类食物链后也造成食品安全风险。