甘蓝型油菜湘油15来源于国家油料改良中心湖南分中心; 本试验中所用到的引物均由南京金斯瑞合成。

取幼嫩的油菜叶片, 参照DNA提取试剂盒(购于天根公司)说明书提取油菜基因组DNA。使用肖钢等^[15]设计的FAD2基因编码区保守序列的扩增引物P1/P2, 以基因组DNA为模板采用PrimeSTAR HS DNA聚合酶(TaKaRa, Japan)进行高保真扩增。扩增体系包含10× buffer 5 µ L, dNTP (2.5 µ mol L^-1) 4 µ L, 正、反向引物各1 µ L, DNA 1 µ L, PrimeSTAR HS DNA聚合酶1 µ L, 用ddH₂O补足50 µ L。反应条件为95℃ 5 min; 95℃ 50 s, 58℃ 50 s, 72℃ 2.5 min, 28个循环; 72℃ 10 min。用1.5% 琼脂糖凝胶检测PCR结果。将PCR产物纯化回收后, 进行加A反应, 然后将其连接到pMD18-T载体(TaKaRa, Japan), 转化到大肠杆菌中, 由铂尚公司完成测序工作。

参考Kiefer等^[16]的方法采用CTAB法提取油菜总RNA, 按照消化试剂盒(TaRaKa, Japan)说明书操作, 去除RNA中的基因组DNA。将消化后的RNA按照SMATERTM RACE cDNA扩增试剂盒说明扩增BnFAD2-C1基因全长cDNA, 并由铂尚生物技术(上海)有限公司测序。

根据已获得的全长cDNA序列, 在该基因3′ UTR序列区域设计特异性引物进行定量PCR检测。引物序列为, C1-FAD2-F (正向): 5′ -TTTCTCTTG GTCTGGTTTAGTCTTT-3′ , C1-FAD2-R (反向): 5′ -A TAACACAACAAAATGAGACAATAA-3′ ; 采用上述方法提取油菜不同组织及不同发育时期种子的RNA, 包括根、花、角果皮(开花后10、15、20、25、30、35和40 d), 种子(开花后10、15、20、25、30、35和40 d)。将RNA按照上述方法消化后, 按照PrimeScript II 1st strand cDNA Synthesis Kit)说明书(TaKaRa, Japan)进行cDNA第1链的合成, 选择2Actin作为内参基因, 进行定量PCR检测。反应体系为20 µ L, 2× SYBR Premix ExTaq10 μ L, 正、反向引物各 0.5 μ L, 第1链cDNA 0.5 μ L, ddH₂O 8.5 μ L。在Bio-Rad CFX 96 定量PCR仪上扩增, 程序为95℃ 30 s; 95℃ 5 s, 60℃ 30 s, 40个循环。

根据油菜基因组和甘蓝基因组的同源性分析, 与甘蓝相比, 油菜BnFAD2-C1基因的5° UTR序列内部缺失很长一段序列, 该序列是甘蓝的内含子区域, 那么以油菜基因组DNA和cDNA为模板进行PCR扩增, 根据油菜与甘蓝的同源性, 在甘蓝BnFAD2- C1基因5° UTR上游约2000 bp处设计特异性引物C1-QF (正向): 5′ -GGTGGTGACTAATTGGTTCCTT GTG-3′ 与位于BnFAD2-C1基因编码区内部的反向引物C1-R: 5′ -GATTGCTTTCTTGAGGTCTCCGAG- 3′ 共同扩增。然后将PCR产物克隆到大肠杆菌中, 测序。利用PLACE和PlantCARE网站对BnFAD2-C1启动子及内含子序列进行预测分析。

取开花后25 d的油菜角果, 嵌入含有不同浓度茉莉酸的MS培养基中(pH 6.0)处理48 h, 茉莉酸浓度依次为0、25、50、75、100、125和150 µ mol L^-1。然后提取种子的RNA, 并进行反转录和定量PCR检测, 具体方法分别参照1.2和1.3。

使用P1、P2引物, 从油菜基因组中高保真扩增得到一个FAD2拷贝基因, 长度约1100 bp (图1)。将其转化到大肠杆菌后测序, 获得1155 bp序列信息(图2), 该序列与油菜基因组数据库同源比对, 结果发现该序列定位在C1染色体上, 同源性为100%, 因此将其命名为BnFAD2-C1; 将其与甘蓝基因组数据库同源比对, 同源性达到100%。采用RACE技术扩增了175 bp的5° UTR序列和212 bp的3° UTR序列, 并确定了BnFAD2-C1基因的转录起始位点。

图1

Fig. 1

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图1 BnFAD2-C1基因编码区序列高保真扩增结果Fig. 1 Fidelity amplification ofBnFAD2-C1 coding sequence

图2

Fig. 2

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图2 BnFAD2-C1基因编码区序列Fig. 2 Coding sequence of BnFAD2-C1gene

采用荧光定量PCR技术, 针对不同组织及不同发育时期的种子进行定量分析(图3), BnFAD2-C1基因主要在种子中表达, 在其他组织中几乎不表达。并且在油菜种子发育的前期, BnFAD2-C1基因只有本底表达的水平, 进入中期即油脂合成期时, 该基因出现迅速高表达现象, 并且延续到种子成熟, 其表达量一直持高不下。说明BnFAD2-C1属于种子特异性表达基因, 并且在种子发育的中期有诱导现象, 可以将其定义为诱导型种子特异表达基因。

图3

Fig. 3

Figure Option ViewDownloadNew Window

图3 BnFAD2-C1基因在不同组织中的表达模式 a: 油菜种子不同发育时期BnFAD2-C1基因表达模式; b: 油菜不同组织BnFAD2-C1基因表达模式; c: 油菜角果皮不同发育时期BnFAD2-C1基因表达模式。Fig. 3 Expression pattern of BnFAD2-C1 gene in different tissues a: Expression pattern of BnFAD2-C1 in developmental stages of rape seeds; b: Expression pattern of BnFAD2-C1in different tissues of rapeseed; c: Expression pattern of BnFAD2-C1 in developmental stages of rape siliqua walls.

基因表达情况的变化主要取决于基因的转录调控过程, 而转录调控过程中发挥关键作用的因素则是启动子区域。为了研究启动子在转录过程中如何发挥调控作用, 首先克隆了该基因的启动子序列。根据甘蓝和油菜基因组数据库信息, 设计特异引物C1-QF/C1-R, 分别以基因组DNA和cDNA为模板, 使用高保真酶HS PrimerSTAR (TaKaRa, Japan)扩增BnFAD2-C1基因5° 端侧翼序列(图4), 以cDNA为模板的扩增结果相对于以DNA为模板的扩增结果约少1000 bp, 即在基因组DNA中存在, 而在cDNA中并不存在; 同时, 测序结果显示, 在5° UTR内部穿插了935 bp核酸序列, 这段序列长度在以cDNA为模板扩增的测序结果中并未发现, 因此可证明这段序列应为内含子序列。同时, 测序结果显示, 在5° UTR上游区域存在1924 bp的核酸序列, 应为启动子序列, 该基因全长序列的结构模式如图5所示, 内含子嵌入5′ UTR内部, 位于翻译起始位点ATG上游8 bp处, 转录起始位点位于内含子上游167 bp处。BnFAD2-C1基因启动子区域与甘蓝的同源性很高, 仅有一个碱基的差异, 5′ UTR区域也只存在一个碱基的差异, 但是油菜BnFAD2-C1基因的内含子区域比甘蓝缺失了37个碱基序列。

图4

Fig. 4

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图4 BnFAD2-C15° 端侧翼序列高保真扩增结果 1: 以DNA为模板经引物C1-QF/C1-R扩增所得电泳结果; 2: 以cDNA为模板经引物C1-QF/C1-R扩增所得电泳结果。Fig. 4 Fidelity amplification of the 5° flanking sequence of BnFAD2-C1gene 1: amplification using primer C1-QF/C1-R and taking DNA as template; 2: amplification using primer C1-QF/C1-R and taking cDNA as template.

图5

Fig. 5

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图5 BnFAD2-C1基因结构模式图Fig. 5 Model of BnFAD2-C1 gene structure

BnFAD2-C1基因中内含子位于5′ UTR内部, 这一结构特征同样存在于拟南芥、棉花、大豆和芝麻中, 且此类内含子序列均以GT开始, 以AG结束, 为GT-AG结构模式, 序列长度从420~3150 bp不等(图6)。

图6

Fig. 6

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图6 不同植物体中FAD2基因结构比较Fig. 6 Comparison of FAD2 gene structures in different species

基因的表达主要受转录水平的调控, 其中启动子发挥关键作用。从BnFAD2-C1基因的表达量分析可知, 该基因在种子发育中期具有诱导种子表达的现象。那么, 为了探明BnFAD2-C1基因表达调控的机制, 现采用生物信息学方法分析该基因的启动子序列。如图7所示, 在启动子序列中存在一些胚乳特异性表达元件(GCN4-motif, skn-1), 赤霉素应答元件(P-box, GARE), 热激蛋白结合位点(HSE), 脱落酸应答元件(ABRE, MBS), 茉莉酸应答元件(CGTCA-motif), 水杨酸应答元件(TCA-element), 抗性应答元件(TC-rich), 分生组织表达特异性元件(CAT-box), 厌氧诱导表达元件(ARE), 光诱导元件(AE-box、GA-motif、ACE、3-AF1和CATT-motif)。核心启动子元件TATA-box存在于-25~ -32 bp, 具有增强启动子功能效应的元件CAAT-box存在于-53~ -57 bp。

图7

Fig. 7

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图7 BnFAD2-C1基因启动子及内含子序列生物信息学分析结果Fig. 7 Bioinformatic analysis of the nucleotide sequences of BnFAD2-C1 gene promoter and intron

利用PlantCARE和PLACE网站预测分析内含子序列, 发现在内含子+1027~ +1030 bp处和+944~ +948 bp处分别存在TATA-box和CAAT-box元件。另外也存在一些类似启动子中的元件, 如胚乳特异表达元件(GCN4-motif, skn-1), 光诱导元件(CATT- motif、Box I、3-AF1和ATCT-motif), 厌氧诱导元件(ARE)。

不同浓度的茉莉酸处理开花后25 d的油菜角果, 然后经定量PCR检测分析显示, 当茉莉酸浓度在0~50 µ mol L^-1时, 随着茉莉酸浓度的增加, 种子中BnFAD2-C1基因的表达量逐渐增加, 但是表达量增加的量不到0.3倍; 当茉莉酸浓度大于50 µ mol L^-1时, 随着其浓度的增加, BnFAD2-C1基因表达量下降, 当茉莉酸浓度达到150 µ mol L^-1时, BnFAD2-C1基因的表达量下降一倍多(图8), 说明该基因在表达过程中确实受到茉莉酸的影响。

图8

Fig. 8

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图8 不同浓度茉莉酸处理后种子BnFAD2-C1基因相对表达量Fig. 8 Relative expression level of BnFAD2-C1 gene in seed after treated with different concentrations of JA