2.1HaPR1全长cDNA的获得与序列分析

通过对核盘菌诱导向日葵转录组数据分析, 获得一个功能注释为病程相关蛋白1基因的全长unigene序列。为确认该序列的准确性, 根据其两端非编码区设计特异引物, 以向日葵叶总RNA的逆转录产物cDNA为模板, 进行PCR扩增, 获得1条约600 bp的cDNA特异扩增条带。对重新测序获得的HaPR1基因cDNA序列的ORF finder分析表明该基因的开放阅读框(ORF)长489 bp, 编码162个氨基酸, GenBank登录号为KR071874。

ProtParam预测该基因编码蛋白分子量约为17.52 kD, 理论等电点为8.19, 为碱性蛋白。携带负电荷的氨基酸(Asp+Glu)的总数目为6, 正电荷(Arg+Lys)的数目为8。该蛋白分子式为C₇₆₁H₁₁₃₉N₂₂₃O₂₃₅S₁₁, 原子总数2369, 为稳定蛋白。信号肽预测表明HaPR1蛋白的第1~第25个氨基酸为信号肽序列, 具有6个保守的半胱氨酸结构基序列, 含有4个保守的allergen V5/Tpx-1 related结构域(图1)。BlastP分析该蛋白具有完整的SCP超家族保守结构域, 属于PR1-like蛋白。

图1

Fig. 1

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	图1 HaPR1与其他植物PR1蛋白氨基酸序列同源性比较Fig. 1 Alignment of full-length amino acid residues among

BlastP序列比对后发现HaPR1与多条蛋白质序列有不同程度的相似, 选择与向日葵HaPR1相似程度高的10种其他植物PR1蛋白进行多序列比对发现, HaPR1蛋白与其他物种PR1蛋白的氨基酸序列的一致性为58.39%~66.46%, 信号肽间的相似性较低, 而成熟肽之间的相似性较高(62.77%~72.46%)。系统进化树分析表明, 向日葵PR1蛋白与咖啡Coffea canephora(AGK89727)和茶树Camellia sinensis(AHA56682)的进化关系最近, 属于同一个分支(图2)。

图2

Fig. 2

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	图2 不同植物PR1蛋白的系统进化分析 黑点表示从向日葵中克隆的HaPR1氨基酸序列。Fig. 2 Phylogenetic analysis of PR1 from different plant species Black dot stands for HaPR1 amino acid sequences from H. annuus.

2.2HaPR1在向日葵不同组织表达特性分析

在向日葵开花后期, 取同一植株的根、茎、叶、花、盘和种子, 提取RNA并逆转录为cDNA进行不同组织表达特性分析。设种子中的HaPR1基因表达量为1, 比较分析HaPR1基因在向日葵不同器官中的表达特性。实时荧光定量PCR分析表明, HaPR1基因在向日葵叶中表达量最高, 其次是根、盘、种和花, 在茎中的表达量最低(图3)。其中, 在叶中表达水平分别是根、盘、种、花和茎的1.90、8.13、10.13、10.67和634.55倍。

2.3HaPR1在生物和非生物胁迫条件的表达

图3

Fig. 3

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	图3 qRT-PCR分析向日葵不同器官中HaPR1基因的表达Fig. 3 Expression of HaPR1 gene in various sunflower organs by qRT-PCR

取各种胁迫处理后的向日葵叶片和根提取RNA, 进行实时荧光定量PCR分析表明(图4), 当向日葵叶片受到核盘菌诱导时, HaPR1基因的表达量随着胁迫时间的延长呈现先升高后降低的趋势, HaPR1基因的表达量12 h达到最高, 此后随着时间的延长, 表达水平逐渐降低, 12 h表达量为对照的4.07倍。当向日葵叶片受到核盘菌代谢物诱导时, HaPR1基因的表达量24 h达到最高, 24 h表达量为对照的7.75倍。当向日葵叶片受草酸胁迫时, HaPR1基因表达量随着胁迫时间的延长逐渐升高, 于24 h达到最高, 为对照的14.52倍, 此后随时间延长, 表达量下降。当向日葵根受到盐(NaCl)和干旱(PEG-6000)胁迫时, HaPR1基因表达量均随着胁迫时间的延长逐渐升高, 12 h达到最高, 分别是对照的1.82倍和1.64倍, 此后随时间延长, 表达量逐渐下降。由此可以看出, 干旱、盐、草酸、核盘菌及其代谢物均能诱导向日葵HaPR1的表达, 其中草酸、核盘菌及其代谢物均显著诱导叶片HaPR1基因的上调表达, 表达量较对照提高4.07~14.52倍, 而盐(NaCl)和干旱(PEG- 6000)胁迫时, HaPR1表达量较对照提高1.64~1.82倍(图4)。

图4

Fig. 4

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	图4 以qRT-PCR分析生物和非生物胁迫处理对HaPR1表达的影响 设0 h的表达量为1, 数据为3次独立试验的平均值± 标准误不同字母表示差异显著(P < 0.05)。Fig. 4 Effect of biotic and abiotic stresses on HaPR1expression by qRT-PCR The 0 h expression level is assigned a value of 1. Values are the mean ± SE of three biological replicates. Bars with different letters show significant difference at P< 0.05.

2.4 植物表达载体构建及转基因烟草的获得

将pROK2质粒和目的基因的双酶切产物连接, 转入大肠杆菌TOP10感受态中, 涂布于含有卡那霉素的LB培养平板上, 37℃培养16 h, 长出转化菌TOP10-pROK2-HaPR1, 随机挑取单菌落进行菌液PCR检测, 电泳结果如图5; 将菌液PCR检测为阳性的转化子提取质粒, 用Xba I和Kpn I限制性内切酶进行双酶切鉴定, 电泳结果如图6。由此可知, HaPR1基因成功整合到植物表达载体当中。然后用叶盘法将HaPR1转化烟草, 通过抗性筛选, 获得具有卡那霉素抗性的烟草, 提取转HaPR1基因烟草的RNA, 反转录成cDNA, 进行RT-PCR鉴定, 结果表明获得了能够正常转录的转基因植株(图7)。

图5

Fig. 5

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	图5 HaPR1转化大肠杆菌的菌液PCR检测 M: DL2000; 1~6: TOP10-pROK2-HaPR1菌液PCR产物。Fig. 5 Bacteria liquid PCR identification of HaPR1 transformed to Escherichia coli M: DL2000; 1-6: Product of colonial PCR of TOP10-pROK2-HaPR1.

图6

Fig. 6

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	图6 重组质粒pROK2-HaPR1酶切鉴定 M: DL2000; 1, 2: 重组质粒pROK2-HaPR1。Fig. 6 Identification of recombinant plasmid pROK2-HaPR1 by restriction enzyme M: DL2000; 1, 2: pROK2-HaPR1.

图7

Fig. 7

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	图7 转基因烟草RT-PCR检测 M: DL2000; L1~L8: 转基因烟草株系; WT: 非转基因烟草株系; P: 阳性对照。Fig. 7 RT-PCR identification of transgenic tobacco plants M: DL2000; L1-L8: Transgenic lines; WT: non-transgenic line; P: positive plamid.

2.5 转基因烟草抗病性及防御酶活性测定

对8株转HaPR1基因烟草进行了抗菌核病测定, 其中有2株(L3和L5)表现较好的抗病性, 叶面不发病或与菌碟交界处只出现少量小斑点, 而野生型烟草则出现明显的病斑(图8)。为了明确转基因烟草叶片的抗病机制, 对L3和L5进行了防御酶活性测定, 结果表明(图9), 在接种核盘菌前, 转基因烟草叶片(L3和L5)中POD和CAT活性显著高于对照(WT), 当接种核盘菌后, 转基因烟草的CAT活性随时间的延长逐渐升高, 而对照烟草则显著下降; 转基因烟草和对照烟草叶片的POD活性均随时间延长逐渐下降, 但转基因烟草POD活性下降速度显著快于对照; 在未接核盘菌前, 转基因烟草和对照烟草叶片的SOD活性无显著差异, 当接种核盘菌后, 转基因烟草和对照烟草的SOD活性12 h后逐渐升高, 24 h达到最高, 48 h后逐渐降低, 但在核盘菌侵染过程中, 转基因烟草SOD活性显著高于对照; 在接种核盘菌前以及接菌后, 转基因烟草叶片中MDA含量显著低于对照(图9)。以上结果表明, 烟草中导入的HaPR1基因通过提高与抗性相关的酶(SOD、POD和CAT)活性和降低植物体内MDA含量来提高对核盘菌的抗病性。

图8

Fig. 8

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	图8 转基因烟草(L3和L5)和非转基因烟草(WT)接种核盘菌48 h后叶片症状Fig. 8 Symptom of transgenic tobacco (L3 and L5) and nontransgenic tobacco (WT) at 48 hours after inoculation

图9

Fig. 9

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	图9 核盘菌对转基因烟草防御酶活性及丙二醛含量的影响 数据为3次独立处理试验的平均值± 标准误, 不同字母表示差异显著(P < 0.05)。Fig. 9 Defense enzyme activity and MDA content in transgenic tobacco treated by S. sclerotiorum Values are the mean ± SE of three biological replicates. Bars with different letters show significant difference at P< 0.05.

目前, 研究发现PRs基因家族中的PR1基因在多种植物中能被病原菌、生物因素和非生物因素诱导, 通常被认为是植物系统获得抗性的标记基因。本试验以向日葵龙食葵2号为材料, 克隆得到了HaPR1基因cDNA全长序列。生物信息学分析表明, 该基因的氨基酸序列与其他植物的PR1基因具有高度同源性, 长度也基本相似, 成熟肽序列与其他植物有很高的相似性, 但信号肽序列构成上有较大差异。该基因C端含有典型的SCP_PR1_like结构域, 说明PR1基因在不同植物中具有一定的保守性。前人研究表明, 碱性PR1蛋白具有更高的抗真菌活性。本研究中HaPR1蛋白预测理论等电点为8.19, 属于碱性蛋白, 理论上具有较强的抑菌活性, 但由于不同植物的PR1基因的功能存在较大差异, 仅从氨基酸序列和结构推测其功能是不可靠的, 对此需要进一步的研究和验证。

研究表明, 许多PR基因在植物不同组织及不同生育期表达存在差异, 例如水稻JIOsPR10基因在根、茎、花中表达, 而在叶中不表达^[23]; 湖北海棠MhPR8基因在根中的表达量最大, 其次是茎, 在叶片中的表达最低^[24]; 小麦TaLr35PR2基因在叶中表达量最高, 其次是茎, 在根中不表达^[25]。这种组织特异性表达不仅说明PR基因参与了不同类型的免疫反应, 也表明该基因在植物正常生长发育过程中发挥一定作用。本研究发现, HaPR1基因主要在向日葵叶片中表达, 这与大多数PR蛋白能在叶片中表达相一致, 推测其在向日葵叶片的生长发育或防御反应中具有重要的作用。

大量报道已证明, PR1基因不仅受生物和非生物因素的诱导, 同时也受植物生长调节剂等物质的调控。PR1基因的表达能够增加植物抵御病害和其他各种胁迫的能力。侯丽霞等研究发现, 葡萄PR1基因表达受霜霉病菌、低温、盐和干旱胁迫显著诱导, 同时SA、ABA、JA、NO、H₂O₂和H₂S等也可诱导其大量表达^[26]; 王艳等^[27]也研究表明, 猪毛菜SfPR-1基因不仅响应盐、干旱、冷害和H₂O₂的诱导, 同时也受SA、JA、ABA和乙烯的调控。本研究发现, HaPR1可响应多种胁迫, 干旱、盐、草酸、核盘菌及其代谢物均能诱导HaPR1上调表达, 其中由核盘菌及其代谢产物和核盘菌主要的致病因子草酸诱导后HaPR1的表达量能提高4.07~14.52倍, 而受盐和干旱胁迫时, HaPR1表达量较对照提高了1.64~ 1.82倍, 该结果说明HaPR1能够响应核盘菌及其毒素的侵袭。此外, 对过量表达HaPR1转基因烟草叶片进行菌核病抗性测定, 试验结果同样证明HaPR1过量表达可以提高植株对核盘菌的抗性。由此说明, 该基因在向日葵抗病机制中具有重要作用。

目前, 通过转基因方法确定了某些PR1基因具有抗病功能^{[8, 9, 10]}。PR1基因是多基因家族, 但并非所有PR1基因都具有抗病功能。研究表明PR1基因家族中只有少数成员表现出抗菌功能, 有的PR1基因参与发育调控, 多数具有未知的生物学功能。本研究表明HaPR1基因的表达受核盘菌、草酸等致病因子显著诱导, 那么HaPR1基因是否参与向日葵对菌核病的防御过程?为更多了解HaPR1基因的功能, 构建了植物表达载体pROK2-HaPR1, 并获得了转HaPR1基因的烟草植株, 对转基因烟草进行抗核盘菌测定发现转化烟草对核盘菌具有较高的抗性。通过对转基因烟草防御酶活性及丙二醛含量的测定, 发现转基因烟草叶片较对照显著提高了SOD、POD和CAT活性, 并降低了丙二醛含量。从而推断HaPR1基因具有抗核盘菌的功能。植物与病原物互作中, 不同的病程相关蛋白参与不同的信号传导途径, HaPR1基因是否参与其他病害的防御过程以及具有别的生物学功能还需进一步研究。

克隆了1个向日葵病程相关蛋白1基因HaPR1的cDNA全长序列, 其OFR为489 bp, 编码162个氨基酸, 具有6个保守半胱氨酸, 4个保守的allergen V5/Tpx-1结构域。HaPR1的相对表达量在向日葵叶中最高, 根中其次, 茎中最低。干旱、盐、草酸、核盘菌及其代谢物均可显著诱导其表达。该基因在烟草中过量表达提高了对核盘菌的抗性, 转基因烟草叶片在核盘菌胁迫下显著提高SOD、POD和CAT活性, 降低MDA含量。初步推断HaPR1具有抗核盘菌的功能。