引用本文
李定琴, 陈玲, 李维蛟, 柯学, 余腾琼, 李娥贤, 黄兴奇, 程在全. 云南3种野生稻中抗白叶枯病基因的鉴定. 41(3): 386-393
LI Ding-Qin, CHEN Ling, LI Wei-Jiao, KE Xue, YU Teng-Qiong, LI E-Xian, HUANG Xing-Qi, CHENG Zai-Quan. Identification of Bacterial Blight Resistance Gene in Yunnan Wild Rice. Acta Agronomica Sinica, 41(3): 386-393  
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云南3种野生稻中抗白叶枯病基因的鉴定
李定琴, 陈玲, 李维蛟, 柯学, 余腾琼, 李娥贤, 黄兴奇, 程在全*
云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所 / 云南省农业生物技术重点实验室 / 农业部西南作物基因资源与种质创制重点实验室, 云南昆明 650223
* 通讯作者(Corresponding author): 程在全, E-mail: czquan-99@163.com
收稿日期:2014-12-19
基金:本研究由国家自然科学基金项目(31000746, 31160067, U1302265), 国家公益性行业(农业)科研专项(201003021), 云南省高端人才项目(2012HA002)和云南省应用基础研究项目(2010CD098)资助
摘要

白叶枯病是水稻生产上最重要的细菌性病害之一, 培育抗病新品种是防治白叶枯病最经济有效的途径。然而, 栽培稻来源的抗病基因数量有限, 并且部分抗病基因的抗病谱窄。因此, 从野生稻中发掘抗病基因, 将有利于培育抗病谱广且抗病能力强的水稻新品种。本研究通过抗性鉴定和PCR分析, 检测云南野生稻中的抗白叶枯病基因。结果表明, 云南野生稻对2个代表性白叶枯病菌Y8和PXO99具有不同程度的抗性, 疣粒野生稻甚至达到免疫的程度。功能标记检测结果显示, 3种野生稻中均不含 xa5、 xa13和 Xa21抗病基因, 元江普通野生稻含 Xa23和 Xa3/ Xa26基因或其同源基因, 景洪普通野生稻中含 Xa1、 Xa3/ Xa26和 Xa27基因或同源基因, 药用野生稻含 Xa3/ Xa26基因或同源基因, 而疣粒野生稻含有 Xa27抗性基因。本研究结果为进一步发掘和克隆云南野生稻中的抗白叶枯病新基因提供了理论参考。

关键词: 野生稻; 白叶枯病; 抗性基因; PCR鉴定
Identification of Bacterial Blight Resistance Gene in Yunnan Wild Rice
LI Ding-Qin, CHEN Ling, LI Wei-Jiao, KE Xue, YU Teng-Qiong, LI E-Xian, HUANG Xing-Qi, CHENG Zai-Quan*
1Institute of Biotechnology and Germplasm Resources, Yunnan Academy of Agricultural Sciences / Yunnan Provincial Key Laboratory of Agricultural Biotechnology / Key Laboratory of Southwestern Crop Gene Resources and Germplasm Innovation, Ministry of Agriculture, Kunming 650223, China
Abstract

Bacterial blight (BB) is one of the most destructive diseases in rice production. Developing resistance variety is the most efficient and economical solution to control this disease. Owing to the limited resistance genes from cultivated rice and the narrow spectrum of some BB resistance genes, wild rice become an important resource of BB resistance genes with wider spectrum and higher resistance. In this study, seven cloned BB resistance genes were detected in 11 accessions (belonging to Oryza rufipogon, O. officinalis, and O. granulata) of Yunnan wild rice by phenotypic and molecular marker identification. The results showed that Yunnan wild rice had different levels of resistance to BB strains Y8 and PXO99, particularly, O. granulatawas immune to Y8 and PXO99. The resistance genes xa5, xa13and Xa21 were not found in all three wild rice materials. According to functional marker detection, O. rufipogon from Yuanjiang probably carry Xa23 and Xa3/ Xa26; O. rufipogonfrom Jinghong probably carry Xa1, Xa3/ Xa26, and Xa27; and O. officinalisand O. granulata probably carry Xa3/ Xa26 and Xa27, respectively. These results provide a solid basis for exploring and cloning new BB resistance genes from Yunnan wild rice.

Keyword: Wild rice; Bacterial blight; Resistance gene; PCR identification

水稻是全世界最重要的粮食作物, 也是单子叶植物的模式植物。随着世界人口的增加、水资源缺乏、气候变化及各种病虫害的影响, 全世界正面临着提高水稻产量的严峻挑战。白叶枯病是水稻生产面临的重要致灾病害之一, 是由革兰氏阴性菌黄单胞菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, 简称Xoo)引起的细菌性病害, 水稻发病时导致减产10%~20%, 严重时减产50%以上, 甚至绝收[1]。研究表明, 发掘抗病基因, 培育抗病新品种是控制水稻白叶枯病最经济有效的途径。

截至目前, 从不同水稻品种中已鉴定出39个白叶枯病抗性基因, 其中已被克隆的有7个, 即Xa21、Xa1、Xa3/Xa26、xa5、Xa27、xa13和Xa23[2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9]。这些基因的鉴定和克隆为水稻白叶枯病抗性育种提供了丰富的基因源。但由于有些基因的抗菌谱窄, 抗性容易丧失, 或者是隐性基因, 再加上白叶枯病菌生理小种的变异和分化, 使得生产上可供有效利用的基因并不多。因此, 发掘和鉴定新的抗源和基因对于防治白叶枯病具有重要的意义[10, 11]。

野生稻是现代栽培稻的野生近缘种, 具有许多优良的性状和有利基因, 是天然的宝贵基因库[12]。目前从不同野生稻中发掘鉴定的抗白叶枯病基因有8个, 分别是Xa21[2](长雄野生稻)、Xa23[9](普通野生稻)、Xa27[7](小粒野生稻)、Xa29(t)[13](药用野生稻)、Xa30(t)[14](普通野生稻Y238)、Xa32(t)[15](澳洲野生稻)、xa32(t)[16](疣粒野生稻)和Xa35(t)[10](小粒野生稻), 其中只有xa32(t)来自于云南的疣粒野生稻。云南省是亚洲栽培稻的遗传多样性中心和起源中心之一, 拥有中国的全部3种野生稻, 即普通野生稻(Oryza rufipogonGriff.)、药用野生稻(Oryza officinalisWall.)和疣粒野生稻(Oryza granulataBaill.)。云南野生稻在长期的自然逆境条件选择下, 具有许多优良的遗传特性, 如高抗白叶枯病、抗稻瘟病、耐寒冷等[17]。过去对云南3种野生稻的抗白叶枯病基因研究较少, 更缺乏综合研究, 从而制约了对其发掘利用。

尽管目前已鉴定了39个抗白叶枯病基因, 但大多数基因(32个)未被克隆, 部分基因未被定位, 其基因序列或连锁分子标记未知, 无法鉴定, 而大部分已定位基因的紧密连锁分子标记距离目的基因较远, 用于鉴定基因准确性不高。本研究选取云南3种野生稻中抗白叶枯病材料, 其中有些抗白叶枯病, 有些高抗白叶枯病, 甚至对白叶枯病表现免疫, 通过这些野生稻材料鉴定国内外已报道克隆的7个抗白叶枯病基因(来自其他稻种或其他地方的野生稻), 初步确定其中是否含有已报道克隆的抗白叶枯病基因, 旨在为分析揭示抗病机制提供理论指导, 也为从中发掘这些基因应用于水稻抗病育种提供依据, 同时为进一步发掘和利用新的抗白叶枯病基因并培育抗病新品种提供参考。

1 材料与方法
1.1 试验材料

云南景洪普通野生稻(2份)、元江普通野生稻(3份)、药用野生稻(3份)、疣粒野生稻(3份), 东乡野生稻、长雄野生稻(各1份)和对照易感白叶枯病栽培稻02428均种植于云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所温室大棚内。

PCR所用DNA聚合酶为上海申能博彩产品, 质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒为生工生物工程(上海)股份有限公司产品, 限制性内切酶、pMD19T载体购自大连宝生物, 大肠杆菌DH5α 购自天根生化科技(北京)有限公司, 其他试剂均为国产分析纯。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2 白叶枯病菌的接种鉴定

由于野生稻材料数量及处于相同生长发育阶段的植株有限, 所以本实验选取2个代表性白叶枯病菌株用于接种鉴定, 即Y8 (云南典型的强致病菌株)和PXO99 (强毒性广致病菌菲律宾小种6), 病原菌于PSA培养基上经过3 d的扩大培养后, 配制成浓度为1× 109cfu mL-1的接种菌液。选择生长状态一致或接近的叶片, 于15:00左右、温度为28~30℃时, 采用剪叶法接种, 每个菌株接种3个植株, 每个植株3~5片叶, 以感病水稻02428作为对照。接种20 d左右时调查, 计算病斑面积与叶片总面积的比值, 取3个植株的平均值作为抗性指标, < 15%为抗病(R), 15~20%为中抗(MR), 20%~50%为中感(MS), 50%~ 75%为感病(S), > 75%为高感(HS)。

1.3 基因组DNA的提取

分别取0.2 g对照02428和野生稻幼嫩叶片, 于液氮中研磨至粉末状, 用CTAB法[18]提取其基因组DNA。

1.4 抗白叶枯病基因的PCR鉴定

Xa1、Xa3/Xa26、Xa21、Xa27、xa5和xa13基因序列可通过GenBank查询到, Xa23基因尽管已被克隆[9], 但其序列尚未公布, 因此利用与其紧密连锁的EST分子标记C189 (与Xa23的遗传距离为0.8 cM, 在Xa23的抗性育种中选择效率接近100%)鉴定该基因, 参考范宏环等[19]报道的引物和PCR扩增方法。Xa21、Xa27、xa5和xa13基因可根据其序列中的多态性位点设计功能标记进行鉴定, 参照Xia等[20]报道的功能标记引物和扩增方法。由于Xa1、Xa3/Xa26基因中引起抗、感表型变化的多态性位点未被确定, 只能根据其不同来源基因的编码区保守序列设计引物扩增, 引物序列见表1。PCR体系25 μ L, 含10× PCR buffer (含MgCl2) 2.5 μ L、dNTP (各2.5 mmol L-1) 2 μ L、上下游引物(10 μ mol L-1)各1 μ L、模板DNA (25 ng μ L-1) 2 μ L、Taq DNA聚合酶(5 U μ L-1) 0.25 μ L、ddH2O 16.75 μ L。PCR程序为: 94℃预变性5 min, 94℃变性45 s, 55℃ (依各基因引物Tm值而定)退火45 s, 72℃延伸1.0~1.5 min, 35个循环, 72℃延伸10 min。PCR产物用1%~3%琼脂糖凝胶电泳检测。

表1 PCR鉴定所用引物序列 Table 1 Primers used in PCR identification
1.5 Xa1、Xa3/Xa26扩增产物的分析

对上述从不同野生稻中扩增到的Xa1、Xa3/Xa26基因PCR产物进行凝胶回收, 克隆到pMD19T载体上, 转化大肠杆菌, 提取质粒, 酶切鉴定后, 将阳性克隆送上海赛音生物技术有限分司测序。用DNAMAN软件分析测序结果。

2 结果与分析
2.1 云南3种野生稻对白叶枯病的抗性

用Y8和PXO99接种20 d左右发现, 对照02428发病严重, 大部分叶片呈现枯黄症状, 病斑面积比均超过20%。图1和表2表明, 云南3种野生稻对白叶枯病的抗性从中抗到高抗, 甚至免疫。药用野生稻对Y8均为抗病, 但其中1份对PXO99为抗病, 2份为中抗; 1份元江普通野生稻对Y8抗病, 对PXO99中抗, 其余2份元江普通野生稻对2个小种均表现中抗; 1份景洪普通野生稻对2个小种为中抗, 另外1份景洪普通野生稻对Y8抗病, 对PXO99中感; 3份疣粒野生稻对Y8和PXO99均表现高抗甚至免疫。而云南以外的2个野生稻材料, 作为野生稻对照代表材料, 长雄野生稻抗白叶枯病, 而东乡普通野生稻还属于中感和感病。可见云南3种野生稻对PXO99和Y8的抗性强, 尤其是疣粒野生稻。加上许多云南野生稻起源地在地理位置上和其他野生稻、栽培稻是完全隔离的, 周围数千米甚至数十千米都没有其他野生稻或者栽培稻, 独立起源和进化, 没有和其他稻种材料发生基因交流, 因而往往会携带一些特殊的甚至是新的抗白叶枯病基因。

图1 几种野生稻接种2个白叶枯病菌小种后的表型
Y: Y8; P: PXO99。1: 感病对照02428; 2: 东乡野生稻; 3: 长雄野生稻; 4~5: 景洪普通野生稻1和2; 6~8: 元江普通野生稻1, 2, 3; 9~11: 药用野生稻1, 2, 3; 12~14: 疣粒野生稻1, 2, 3; 15: 疣粒野生稻接菌后表型。Fig. 1 Phenotypes of several wild rice treated with two strains of Xanthomonas oryzaepv. oryzae
Y: Y8; P: PXO99. 1: control cultivar 02428; 2: Dongxiang wild rice; 3: Oryza longistaminata; 4-5: O. rufipogon from Jinghong 1, 2; 6-8: O. rufipogon from Yuanjiang 1, 2, 3; 9-11: O. officinalis 1, 2, 3; 12-14: O. granulate 1, 2, 3; 15: phenotypes of O. granulataafter inoculation with Xoo.

表2 云南野生稻对2个白叶枯病菌小种的抗性 Table 2 Resistance of wild rice in Yunnan to two strains of Xanthomonas oryzaepv. oryzae
2.2 云南3种野生稻白叶枯病抗性基因的鉴定

利用xa5、xa13、Xa21和Xa27基因的功能标记检测表明(图2和表2), 供试的14份材料中都能扩增出xa5感病基因带型, 约170 bp, 说明对照和云南3种野生稻中都不含xa5抗病基因。xa13基因功能标记检测表明, 除3份疣粒野生稻未扩增出任何带型外, 所有材料中都扩增出感病基因带型, 说明这些材料中含有与xa13基因等位的显性基因Xa13。Xa21基因的功能标记检测显示, 只有长雄野生稻中扩增出抗病基因带型, 而在02428、东乡野生稻、3份元江普通野生稻和景洪普通野生稻2中扩增出感病基因带型, 药用野生稻和疣粒野生稻中未见任何条带, 由此说明云南3种野生稻中都不含xa5、xa13和Xa21抗病基因。Xa27基因功能标记检测表明, 除对照02428中扩增出感病基因带型外, 东乡野生稻、2份景洪普通野生稻中均扩增出特异的抗病基因带型, 而疣粒野生稻中虽然也扩增出抗病基因带型, 但条带较弱。

利用与Xa23基因紧密连锁的分子标记C189对云南3种野生稻检测发现, 在东乡野生稻、长雄野生稻和3份元江普通野生稻中能扩增出约760 bp的Xa23抗病基因带型, 其余材料未扩增出条带, 初步推测云南元江普通野生稻中含有Xa23基因。

图2 7个抗白叶枯病基因在云南3种野生稻中的PCR鉴定
A: xa5功能标记xa5/Xho I; B: xa13功能标记; C: Xa21功能标记; D: Xa27功能标记; E: Xa23 EST标记; F: Xa1功能标记; G: Xa3/Xa26功能标记。1: 感病对照02428; 2: 东乡野生稻; 3: 长雄野生稻; 4: 元江普通野生稻1; 5: 元江普通野生稻2; 6: 元江普通野生稻3; 7: 景洪普通野生稻1; 8: 景洪普通野生稻2; 9: 药用野生稻1; 10: 药用野生稻2; 11: 药用野生稻3; 12: 疣粒野生稻1; 13: 疣粒野生稻2: 14: 疣粒野生稻3Fig. 2 PCR identification of seven resistance genes in three wild rice materials of Yunnan
A: xa5functional marker xa5/XhoI; B: xa13functional marker; C: Xa21 functional marker; D: Xa27 functional marker; E: Xa23EST marker; F:Xa1 functional marker; G: Xa3/Xa26functional marker. M: DL2000 or DL500 marker; 1: control cultivar 02428; 2: Dongxiang wild rice; 3: Oryza longistaminata; 4: O. rufipogon from Yuanjiang 1: 5:O. rufipogon from Yuanjiang 2; 6: O. rufipogon from Yuanjiang 3; 7: O. rufipogon from Jinghong 1; 8:O. rufipogon from Jinghong 2; 9: O. officinalis 1; 10: O. officinalis2; 11:O. officinalis3; 12:O. granulata1; 13: O. granulata 2; 14:O. granulata 3.

对Xa1和Xa3/Xa26基因的鉴定, 是根据其不同来源基因的编码区保守序列设计引物进行扩增。结果发现, 在东乡野生稻、长雄野生稻和2份景洪普通野生稻中能扩增出Xa1基因约552 bp的条带, 进一步对能扩增出条带的PCR产物单独回收, 与pMD19T载体连接后测序表明, 4份材料的扩增序列与GenBank中的Xa1 (登录号为AB002266)序列相似性很高(图3), 推测这4份材料中具有Xa1基因或其同源基因。对Xa3/Xa26 基因的鉴定表明, 除了对照02428、元江普通野生稻2和3份疣粒野生稻中未扩增出条带, 其余都有约1100 bp的条带, 进一步对这些PCR产物单独回收测序表明, 这些材料中的序列与GenBank中Xa3/Xa26 (登录号为DQ355952)的序列相似性较高, 只存在少数核苷酸的差异, 其中药用野生稻的差异稍大(表3)。

图3 几种野生稻中Xa1基因(552 bp)的多序列比对结果
1: 东乡野生稻; 2: 长雄野生稻; 3: 景洪普通野生稻1; 4: 景洪普通野生稻2。Fig. 3 Multiple alignment of Xa1 gene in several wild rice materials (partial sequence)
1: Dongxiang wild rice; 2: Oryza longistaminata; 3: O. rufipogon from Jinghong 1; 4:O. rufipogon from Jinghong 2.

表3 几种野生稻中Xa3/Xa26基因核苷酸序列差异 Table 3 Difference of DNA sequences ofXa3/Xa26 gene among several wild rice materials
3 讨论

彭绍裘等[21]的研究表明, 用湖南安仁县水稻病叶分离的白叶枯病菌接种云南3种野生稻后, 疣粒野生稻表现高抗甚至免疫, 药用野生稻抗病, 而普通野生稻则感病。程在全等[22]的研究结果则有一些不同, 主要是普通野生稻的白叶枯病抗性方面, 云南元江普通野生稻和景洪红芒型普通野生稻高抗白叶枯病, 而景洪直立型普通野生稻不抗白叶枯病。本研究用Y8和PXO99两个白叶枯病菌生理小种接种鉴定, 发现疣粒野生稻对2个小种均表现高抗甚至达到免疫程度, 这与前人的研究结果一致; 本研究的抗性鉴定结果与程在全等人的基本一致, 只是元江普通野生稻的抗性表现有差异, 可能的原因是所用鉴别菌株的致病性不同, 抗性鉴定的时间、温度、湿度等外部因素不同, 供接菌鉴定的材料生长状态不一样, 单株间存在差异, 或者材料数量有限。为防止出现上述可能的情况, 在接种鉴定时, 应尽量选择较多的植株和生长状态接近一致的叶片, 在固定的时间和条件下进行, 在与前人的结果出现较大差异时, 应多次重复, 避免鉴定结果的误差。

至今已鉴定的抗白叶枯病基因中, 只有xa32(t)来自云南疣粒野生稻, 其他抗白叶枯病基因都不是来自云南野生稻。利用功能标记鉴定结果发现, 云南3种野生稻中都不含xa5、xa13和Xa21抗病基因。在元江普通野生稻中, 仅检测到Xa23基因EST标记带型和Xa3/Xa26基因部分片段, 结合元江普通野生稻对PXO99的抗性表型为中抗, 说明元江普通野生稻中可能含有来自普通野生稻的Xa23基因, 但到底是抗病基因还是感病基因, 需待该基因序列公布并根据其开发功能标记才能确定。对于2份景洪普通野生稻来说, 都能扩增到Xa27抗性基因带型, 也能扩增到Xa1和Xa3/Xa26基因部分片段, 说明来自小粒野生稻的Xa27基因也可能存在于景洪普通野生稻中, 但鉴于抗性表型鉴定的结果, 尚不能确定景洪普通野生稻中是否含有Xa1和Xa3/Xa26抗病基因, 需用基因特定的鉴别菌株鉴定, 并结合功能标记鉴定来确定。不管在元江普通野生稻还是在景洪普通野生稻中, 都只能扩增出Xa21感病基因带型, 说明在云南普通野生稻中存在Xa21基因的等位基因或同源基因, 而药用野生稻和疣粒野生稻中不存在, 本实验从不同角度得出了与钱君等[23]相一致的结果。在3份药用野生稻中, 只有Xa3/Xa26基因能扩增出产物, 但由于药用野生稻中扩增产物与Xa3/Xa26基因的核苷酸差异较大, 其含有Xa3/Xa26抗病基因还是感病基因, 将进一步通过试验确认。

鉴于云南药用野生稻对白叶枯病表现中抗到抗性, 推测其中含有抗白叶枯病新基因的可能性较大。值得注意的是, 在疣粒野生稻中, 仅有Xa27基因功能标记扩增出抗性基因带型, 但由于条带较弱, 无法回收确认, 下一步将从RNA水平上鉴定。抗性鉴定结果表明疣粒野生稻对白叶枯病表现高抗甚至免疫, 程在全等[24]的研究表明疣粒野生稻高抗或免疫白叶枯病并非借助其特殊叶片结构的物理作用, 而已报道克隆的其他6个抗白叶枯病基因都未在其中发现, 所以推测疣粒野生稻中具有未知的抗白叶枯病新基因, 值得进一步发掘和利用。

有报道起源于云南的稻种资源扎昌龙中目前已经鉴别出3个抗白叶枯病基因[25], 同样起源于云南的3种野生稻, 其不同的抗白叶枯病材料抗菌谱不同, 抗性强度也有差异, 暗示含有的抗白叶枯病基因类型、数量和基因组合都有较大差异。对已报道的抗白叶枯病基因的检测, 可为直接发掘这些基因提供指导, 而更重要的是, 未来在识别、发掘、利用这些野生稻材料中的抗白叶枯病新基因时, 应关注本文已鉴定出来的基因以外的其他基因。

4 结论

鉴定了云南3种野生稻对云南白叶枯病菌强致病菌株Y8和菲律宾广谱强致病菌株PXO99的抗性, 确认了3种野生稻中携带已报道克隆的7个抗白叶枯病基因的情况, 即元江普通野生稻含Xa23和Xa3/Xa26基因, 景洪普通野生稻含Xa1、Xa3/Xa26和Xa27基因, 药用野生稻含Xa3/Xa26基因, 疣粒野生稻含Xa27基因, 或者是这些基因的同源基因。

The authors have declared that no competing interests exist.

作者已声明无竞争性利益关系。

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