高产粳稻(Oryza sativa L. subsp. japonica)品种武香粳9号为转化受体品种; 另一粳稻品种武运粳8号基因组DNA作为模板用于克隆GluA-2基因启动子和信号肽编码序列。

载体pGEM-T购自Promega公司, 农杆菌菌株EHA105和双元载体pCAMBIA1301由澳大利亚Jefferson教授提供, 双元载体pC1300/GN由本实验室自行购建^[16], 大肠杆菌DH5α 为本实验室保存。限制性内切酶、T4 DNA连接酶等购自TaKaRa公司。

根据Takaiwa等^{[13, 14]}和Okita等^[12]发表的谷蛋白基因序列, 在水稻谷蛋白GluA-2前体的N-端含有由24个氨基酸组成的信号肽序列。根据已发表的水稻谷蛋白GluA-2基因的核苷酸序列(GenBank登录号为Y00687), 设计引物Gt1P₆(5′ -CAGGATCCAA TGGCATCCATAAATCGCCCC-3′ )和Gt1P₁₀(5′ -CA CCATGGCTAGGGAGCCATCGCACAA-3′ ), 在引物5′ 末端分别加上BamH I和NcoI酶切位点(下画线表示); 以水稻品种武运粳8号基因组DNA为模板进行PCR扩增, 用于克隆GluA-2基因ATG下游+1 ~ +72位碱基之间的信号肽编码序列(称为GluA-2_SP片段, 图1-a)。设计引物Gt1P₁(5′ -GGCAAGCTTCA CTGCTACCTTTAAGTAAC-3′ )和Gt1P₃(5′ -CGAGG ATCCGTTGTTGTAGGACTAATGAA-3′ ), 从水稻总DNA中扩增GluA-2基因翻译起始密码子ATG上游1.3 kb长的启动子区。在2个引物的5′ 末端分别加上了Hind III和Bam HI限制性内切酶位点(下画线表示)。扩增的启动子片段称为GluA-2_Pro片段。PCR扩增程序为: 95℃、5 min; 95℃、1 min, 50℃、1 min, 72℃、1 min, 30个循环; 72℃、10 min。PCR产物经克隆入质粒pGEM-T后进行序列分析。

将GluA-2_Pro和GluA-2_SP片段连接在一起, 形成GluA-2_Pro+SP片段。然后, 将该片段经Hind III和NcoI双酶切, 替代双元载体pCAMBIA1301中GUS编码区上游的CaMV35S启动子, 即构建成双元载体p13GSG (图1-b)。该载体中, 在GluA-2_ Pro启动子与GUS基因编码区(保留有自己的ATG序列)之间即含有GluA-2基因的信号肽编码序列, 信号肽编码序列与GUS编码区序列组成一个融合基因, 经测序证明两者的读码框都没有发生改变。同时, 为比较GluA-2基因信号肽编码序列对GUS基因表达的影响, 又构建了只含有GluA-2基因启动子(GluA-2_Pro)的GUS嵌合基因。用Hind III和Bam HI双酶切GluA-2_Pro片段, 连接入质粒pC1300/GN ^[16]的相应酶切位点中, 构建成含GluA-2_Pro启动子与GUS报告基因相融合的质粒p13GG (图1-c)。构建的载体经冻融法导入农杆菌EHA105中, 并用于水稻转化。

图1

Fig. 1

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	图1 谷蛋白GluA-2信号肽序列(a)及双元载体p13GSG (b)和p13GG (c)中T-DNA区的结构 P35S和T35S分别代表CaMV35S启动子和终止子, Hyg代表潮霉素抗性基因, TNOS代表NOS终止子。Fig. 1 Sequences of rice GluA-2 signal peptide (a), and the T-DNA structure of binary vectors p13GSG (b) and p13GG (c) P35S and T35S represent the promoter and terminator of CaMV35S gene, respectively; Hyg means the hygromycin resistance gene, TNOS means the terminator of NOS gene.

取武香粳9号开花后12 d左右的未成熟胚诱导初生愈伤组织, 作为农杆菌介导转化的受体愈伤组织。按刘巧泉等^[17]的方法进行水稻组织培养及其农杆菌介导的转化。按CTAB法^[18]从转基因水稻叶片中提取总DNA; 参照刘巧泉等^[17]的方法进行GUS编码区片段的PCR扩增, 预期PCR产物片段长为500 bp左右。

按郑霏琴等^[19]的冷酚法从水稻开花后12~15 d的未成熟种子中提取总RNA。取5~10 μ g总RNA, 经55℃变性20 min在1.0%琼脂糖/甲醛凝胶分离后, 按Sambrook等^[20]和Roche公司推荐的方法将RNA转移至尼龙膜(Roche)上, 在紫外交联仪(Bio-Rad)上于254 nm处将RNA固定到膜上, 再以地高辛(Digoxigenin, Roche)标记的GUS基因编码区序列作为探针进行杂交。

在转基因水稻成熟后, 收取成熟种子磨成米粉, 从其淀粉胚乳中分别提取可溶性蛋白和总蛋白。按每1 mg米粉10 μ L抽提液加入可溶性种子总蛋白抽提缓冲液(50 mmol L^-1 Na₃PO₄, pH 7.0, 500 mmol L^-1

NaCl), 在37℃振摇3 h; 然后在15 000转min^-1、4℃离心20 min, 吸取上清液至另一新的离心管中, 保存在4℃备用。按Bradford法^[21]测定蛋白浓度。按Yamagata等^[6]方法提取种子总蛋白。按Sambrook等^[20]的SDS-PAGE程序, 取适量种子总蛋白样品与2× 样品缓冲液混合, 99℃变性处理10 min后, 在12%分离胶和5%积层胶组成的聚丙烯酰胺凝胶上于电泳分离; 经SDS-PAGE分离后, 将蛋白质转移到Nitrocellulose膜上。按AURORA Western blot chemiluminescent detection system (AURORA)推荐的程序进行Western杂交, 所用的抗体为GUS特异的兔免疫抗血清(购自Abcam公司), 按1∶ 10 000稀释。

参照Jefferson^[22]的组织化学染色方法检测转基因水稻中的GUS活性。按Bradford^[21]的方法测定总蛋白含量。

将构建的双元载体p13GSG和p13GG经冻融法分别导入根癌农杆菌菌株EHA105感受态细胞中。按本实验室已建立的农杆菌介导法转化水稻的程序^[17], 将所构建的2个GUS融合基因分别导入水稻品种武香粳9号中, 再生的小苗经生根壮苗后移入网室或人工气候室盆栽。两个融合基因构建中, 各获得20个以上的独立转化子。含GluA-2_Pro+GUS融合基因(载体p13GG)的转基因植株称为GG1、GG2和GG20等, 而含GluA-2_Pro_SP+GUS融合基因(载体p13GSG)的转基因植株称为GSG1、GSG2和GSG20等。每个转化子各含有2~6个转基因水稻植株。转基因水稻植株移栽入大田后, 绝大多数能正常生长、开花并结实。经PCR分析证明GUS融合基因已整合进转基因水稻的基因组中(图2-a)。

图2

Fig. 2

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图2 转基因水稻的PCR (a)和未成熟种子总RNA的Northern杂交分析(b) 图a为转基因水稻植株总DNA的PCR分析, 所用引物为GUS基因特异引物。图b上图为Northern杂交结果, 下图显示总RNA中的28S核糖体RNA。总RNA分别抽提自GG和GSG类转基因水稻植株或未转化植株(标记为WT)的未成熟种子。杂交所用的探针为地高辛标记的反义GUS编码区片段。Fig. 2 PCR (a) and Northern blot (b) analyses of transgenic rice Panels a and b show the PCR analysis using GUS specific primers of total leaf DNA and Northern blot analysis of total RNA from developing seeds of rice plants, respectively. WT means wild type plant, GG and GSG mean the transgenic plants derived from the GG and GSG constructs, respectively. The probe for Northern blot is DIG-labeled anti-GUSDNA fragment.

在转基因水稻开花后12 d左右, 从每一植株上收取40粒左右未成熟种子, 提取总RNA, 并用与GUS基因编码区序列特异的反义DNA探针进行Northern杂交分析, 结果显示在两类转基因水稻植株未成熟种子中都有较高的GUS基因的转录本(图2-b)。从杂交信号的强弱判断, 虽然在不同转化子间的表达量有较大的差异, 但从总体情况分析, 在GSG转基因水稻中, 与GluA-2信号肽序列融合的GUS嵌合基因的表达水平明显高于GG类转基因水稻种子中GUS嵌合基因(即不含信号肽序列、只含GluA-2启动子序列的GUS嵌合基因)的转录水平, 说明有GluA-2信号肽序列的存在, 可提高目标基因在转基因水稻胚乳中的转录水平(图2-b)。

在转基因水稻植株开花后15 d左右, 从已检测为GUS基因阳性的转基因植株上分别取叶片、茎和未成熟种子进行GUS组织化学染色分析。结果显示, 对于GG类转基因水稻植株, 在未成熟种子胚乳中能观察到很强的GUS活性(图3-a); 而在叶片、茎和胚等组织中, 只有极少数转基因植株有GUS活性, 并且较弱, 而绝大多数观察不到GUS蓝色。显示GluA-2启动子可指导外源基因在水稻胚乳中特异性表达, 这与之前的研究相一致^[12]。但是, 在GSG转基因水稻不同组织中都没有检测到GUS活性(图3-b), 暗示与GluA-2信号肽序列融合的GUS嵌合基因虽然可以在转基因水稻种子中高效转录, 但是检测不到外源蛋白的活性表达。

图3

Fig. 3

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	图3 转基因水稻植株GG (a)和GSG (b)发育种子中GUS活性分析Fig. 3 GUS activity analysis of developing seeds of GG (a) and GSG (b) transgenic rice

在转基因水稻成熟后, 收取成熟种子, 从其胚乳中提取种子总蛋白, 用抗GUS的特异抗体进行Western杂交分析, 结果显示在两类转基因水稻成熟种子中都有GUS蛋白的积累(图4-a)。在不同转基因水稻种子中GUS蛋白的表达量有所不同, 这与Northern杂交的结果相类似。但从总体趋势上分析, 在GSG类转基因水稻胚乳中GUS蛋白的积累量明显高于GG类转基因水稻中的(图4-a)。进一步先从转基因水稻成熟种子中提取可溶性蛋白, 然后再从沉淀物中分离出总蛋白, 分别经SDS-PAGE分离后进行Western杂交分析。结果显示, 在GG类转基因水稻成熟种子可溶性蛋白中可检测到GUS蛋白的存在, 而在GSG类转基因水稻种子中可溶性蛋白中却检测不到GUS蛋白(图4-b)。在已不含可溶性蛋白的总蛋白提取物中, 两类转基因水稻中都有较强的GUS蛋白积累, 但是GSG类转基因水稻种子中GUS蛋白的积累量要显著高于前者(图4-c), 这与种子中总蛋白的分析结果相一致。

综合上述结果, 当在GUS基因编码区前加接上GluA-2基因的信号肽编码序列时, 不仅可明显促进GUS融合基因的转录效率, 而且可使最终的蛋白产物表达量也明显增多。对Northern和Western杂交中各杂交信号进行扫描定量比较分析, 可估算在GSG类转基因水稻胚乳中GUS蛋白的表达量比GG类转基因水稻中的要高5~10倍。

图4

Fig. 4

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图4 转基因水稻植株成熟种子蛋白的Western杂交分析 种子蛋白分别抽提自GG和GSG类转基因水稻植株或未转化植株(WT)的成熟种子, 其中a为种子总蛋白, b为种子可溶性蛋白, c为去除可溶性蛋白后的其他蛋白。每个泳道所加的蛋白量一致。图左侧箭头所指为GUS蛋白。Fig. 4 Western blot analyses of proteins from mature seeds of transgenic rice Proteins were extracted from the mature seeds of GG and GSG transgenic plants or their wild type (WT), respectively. Panels a, b, and c mean the total proteins, soluble proteins and the remaining total proteins after extraction of soluble proteins, respectively. The amount of proteins for each lane is same. The arrow at left indicates the expressed GUS protein.