以化感水稻品种PI312777 (Oryza sativaL.)为供体材料^[9], 稗草(Echinochloa crusgalli, BYG)为受体材料。

供试化感水稻PI312777种子经42℃烘干2 h, 蒸馏水浸泡1 d后进行催芽并播于秧盘。三叶期时移到装有Hoagland完全营养液的塑料盆中, 每周更换营养液。14 d后剪取水稻根系, 采用TRIzol试剂提取根部总RNA, 并参照TIANGEN Quant cDNA合成试剂盒合成cDNA。

分别以CT829537转录因子的CDS序列以及5′ 列端的DNA结合位点序列为模板设计该基因的过表达(overexpression)引物和RNAi引物(表1), 以化感水稻PI312777的cDNA为模板进行扩增。将PCR产物克隆到质粒中, 进一步通过酶切将目的片段连接到pTCK303载体上, 分别构建CT829537的RNAi和过表达载体。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 本研究用于构建载体的引物序列 Table 1 Sequences of primers used for vector construction in this study 引物名称Primer 引物序列Primer sequence (5′ -3′ ) CT829537正向RNAi片段 Forward RNAi fragments of CT829537 FF: ATTATCGGGATCCATGGACGGAGCAGGAGGACGTCCAACTG (Bam H I) FR: GGGCGGGGGTACCGCGAGGCATCGAGCATCTTCTTGTAGTA (KpnI) CT829537反向RNAi片段 Reverse RNAi fragments of CT829537 RF: ATTTCGAGCTCATGGACGGAGCAGGAGGACGTCCAACTG (SacI) RR: GGCGGACTAGTGCGAGGCATCGAGCATCTTCTTGTAGTA (SpeI) CT829537过表达引物 Overexpression primer of CT829537 OF: CGGGATCCAATCTTCGGCACTGGCTCC (Bam H I) OR: CGAGCTCGGGTCAGGTGGTCGGTGTA (SacI) CT829537基因定量引物 Gene quantitative primer of CT829537 QF: GTTTGAAGCGCACAGGCAAGAG QR: GGAGGACAAGGAACCGGAGGAG GUS基因引物Primers of GUS GUS-F: GCATGTTACGTCCTGTAGAAACCC GUS-R: CAAAGCCAGTAAAGTAGAACGGT Hpt基因引物Primers of Hpt Hpt-F: GGGGGGTCGGTTTCCACTA Hpt-R: ATCGTTATGTTTATCGGCACTTTG

表1 本研究用于构建载体的引物序列 Table 1 Sequences of primers used for vector construction in this study

重组质粒用冻融法转化农杆菌EHA105, 获得CT829537过表达和RNAi转基因水稻^{[25, 26]}。以野生型PI312777为对照, 分别对水稻新根进行GUS染色。与此同时, 分别利用GUS基因和潮霉素基因(Hpt)的特异引物(表1)对转基因水稻的GUS和Hpt基因进行扩增。

分别提取转基因和野生型PI312777根系RNA, 逆转录成cDNA, 利用CT829537转录因子的特异引物, 并以β -Actin作为内参基因, 进行半定量RT-PCR分析。

进一步以半定量RT-PCR检测结果为阳性的转基因PI312777根系的cDNA为模板, 通过荧光定量PCR (qPCR)比较PI312777根系中的7个与酚酸类化合物合成相关的酶基因在转基因水稻和野生型植株中的表达变化。这些基因包括苯丙氨酸解氨酶基因(PAL)、肉桂酸-4-羟化酶基因(C4H)、羟化酶基因(HYL)、辅酶A连接酶基因(4CL)、O-甲基转移酶基因(OMT)、肉桂酰辅酶A基因(CCA)和肉桂酸脱氢酶基因(CAD), 以β -Actin为内参基因, 各基因的qPCR引物见表2^[27]。qPCR程序为95℃预变性10 min; 95℃变性30 s, X℃退火30 s, 68℃延伸20 s检测荧光强度, 41个循环; 95℃变性15 s, 60℃退火15 s升温10 min至95℃, 95℃变性15 s。根据所生成的阈值(Ct值), 运用2^{-Δ Δ Ct}法计算基因的相对表达变化量^[28]。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 酚酸合成相关基因的荧光定量PCR引物序列 Table 2 Primer sequence for the qPCR of phenolic acid relative genes 关键酶 Key enzyme 登录号 Accession number 种属 Species 引物序列 Primer sequence (5′ -3′ ) 甲羟戊酸激酶 Mevalonate kinase NM 001070895 Oryza sativa F-CAGTCGGCGGCATCAG R-CACCAGCAACCAGAGC 单萜烯合酶 Monoterpenes synthase NM 001071453 Oryza sativa F-GGATGAACTTGGGATTGG R-TCTGGAGAAGGAAGCACC 倍半萜烯合酶 Sesquiterpene synthase AP003911 Oryza sativa F-CGATGATAACAATAACGG R-GTGCCTTGCTTCAACTCT 二萜烯合酶 Diterpene synthase AB089272 Oryza sativa F-AAAGAGCATCCTTGACA R-GAAACATCGTAACCGT 八氢番茄红素合酶 Phytoene synthase DO356431 Oryza sativa F-ATGGAGATGTTTTATGAGGGAT R-CGTCAAGGATTTGTCGGT 角鲨烯合酶 Squalene synthase NM 001058160 Oryza sativa F-GTTTCGCCTTGTCTCCAC R-CAACAGTTTCAACCTCCTT 苯丙氨酸解氨酶 Phenylalanine ammonia-lyase NM 001054016 Oryza sativa F-CCGTGCTCTTTGAGGCTAAC R-GCTTGTGAGTCAGGTGGTCG 肉桂酸-4-羟化酶 Cinnamate-4-hydroxylase NM 001061725 Oryza sativa F-ACCGCAGCGTCTCCTTC R-ACCACCCGAGCATCCAG 羟化酶 Hydroxylase NM 001068556 Oryza sativa F-CCGCCTTCAACGACAA R-CGCCCATACGACGATT 辅酶A连接酶 CoA-ligases X52623 Oryza sativa F-TGGTGGAGTGCGTGCTG R-AGGCGTTGGCGTAGATG O-甲基转移酶 O-Methyltransferases NM 001068677 Oryza sativa F-TGTCCTGTGAAATGGGTG R-CCTCGGAACAAGAACTG 肉桂酰辅酶A Cinnamoyl-CoA NM 001069247 Oryza sativa F-TGGGAGCAGGAATGGCAAAAT R-TTCCGTCCCACCAGCATGAC 肉桂酸脱氢酶 Cinnamoylalcohol dehydrogenases NM 193168 Oryza sativa F-TCGGCGTCGCTAATTTCATCC R-TCGATGGAAGAACGGGCAGAG β -肌动蛋白 β -Actin AB047313 Oryza sativa F-CTGCGGGTATCCATGAGACT R-GCAATGCCAGGGAACATAGT

表2 酚酸合成相关基因的荧光定量PCR引物序列 Table 2 Primer sequence for the qPCR of phenolic acid relative genes

取CT829537-RNAi、CT829537-OE转基因水稻及野生型水稻各3株(三叶一心期), 于Hoagland完全营养液中恢复培养7 d后, 分别与等株数的稗草共培养, 并以单独培养的各供试水稻作为对照, 处理与对照均设3次重复。培养7 d后, 参照Folin-Ciocalteu比色法测定转基因水稻及其野生型水稻根系及根系分泌物中总酚的含量^[29]。

分别收集转基因PI312777及其野生型植株的水培液, 经0.45 µ m滤膜过滤后取5 mL加至垫有滤纸的培养皿中, 以添加等体积双蒸水为空白对照, 分别放入20粒预萌发的稗草种子, 处理与对照均设4次重复。常温培养10 d后, 收集各处理稗草, 120℃杀青30 min, 80℃烘干至恒重。所得原始数据均转化为抑制率(inhibitory rates, IRs), 作为化感潜力评价指标。IRs = (1-TR/CK)× 100%。其中TR为不同处理下的稗草干物质重, CK为对照稗草的干物质重。IR < 0表示存在促进作用, IR > 0表示存在抑制作用。

采用农杆菌介导法将CT829537-OE和CT829537- RNAi载体分别转化到化感水稻PI312777中, 获得CT829537-OE和CT829537-RNAi的T₀代的转基因PI312777。转基因水稻经GUS染色检验显示水稻根部被染成蓝色, 而相同处理的野生型水稻根系颜色未发生变化(图1), 说明OsMYB (CT829537)基因的RNAi和OE表达质粒载体成功转入供试水稻中。进一步以T₁代转基因水稻根部cDNA为模板, 进行潮霉素基因(Hpt)和GUS基因的PCR检测, 电泳结果显示RNAi与OE载体有效遗传至T₁代(图2)。

图1

Fig. 1

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	图1 阳性转基因水稻和野生型水稻的根系GUS染色 WT: 野生型化感水稻PI312777; CT829537-RNAi: CT829537抑制转基因水稻PI312777; CT829537-OE: CT829537过表达转基因水稻PI312777。Fig. 1 GUS dyeing of positive transgenic rice and wild type (WT) rice roots WT: wild type plant of allelopathic rice PI312777; CT829537-RNAi: CT829537 silience transgenic rice PI312777; CT829537-OE: CT829537 overexpression transgenic rice PI312777.

图2

Fig. 2

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	图2 T1代转基因水稻的潮霉素磷酸转移酶基因(Hpt)和GUS基因PCR检测Fig. 2 Amplification of GUS and Hpt gene in T1 transgenic rice plants M: DNA marker (100 bp ladder)

CT829537-OE转基因PI312777的CT829537基因表达量明显高于野生型植株, 而该基因在CT829537-RNAi转基因PI312777中的表达量则较野生型植株明显降低(图3)。

图3

Fig. 3

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	图3 半定量PCR检测CT829537基因在转基因水稻与野生型水稻中的表达量 缩写同图1。Fig. 3 Gene expression level of CT829537 in transgenic rice and WT detected by semi-quantitative RT-PCR Abbreviations are the same as those given in Fig. 1.

如图4所示, 与稗草共生7 d后, CT829537-OE转基因水稻中酚酸代谢途径7个关键酶基因的表达均高于对照。其中苯丙氨酸解氨酶基因(PAL)和羟化酶基因(HYL)上调了3倍和4倍, 肉桂酸-4-羟化酶基因(C4H)、辅酶A连接酶基因(4CL)、肉桂酰辅酶A基因(CCA)分别上调2.14、1.23和2.46倍, 肉桂酸脱氢酶基因(CDA)、O-甲基转移酶基因(OMT)基因表达量分别上调7.26倍和3.73倍。而在CT829537-RNAi转基因水稻中, 与对照植株相比, 除C4H表现微弱上调表达外, 其余6个基因表达均下调, 其中4CL、CCA、HYL下调了6.68、4.20和4.08倍, PAL、CDA、OMT分别下调1.50、1.64和2.14倍。稗草共生长处理后, 7个基因中只有C4H在RNA干扰和过表达转基因水稻中上调表达, 且在CT829537-OE转基因水稻中的表达量高于CT829537- RNAi转基因水稻。

图4

Fig. 4

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	图4 与稗草共培养下, 转基因PI312777与其野生型植株的酚酸代谢关键基因的表达变化 缩写同图1。Fig. 4 Relative expression analysis of the genes relative to phenolic acid synthesis in transgenic PI312777 and WT under rice/BYG co-cultured condition Abbreviations are the same as those given in Fig. 1

与稗草共培养7 d后, 各水稻根系及其培养液中的总酚含量均高于相应的单一种植的对照水稻组(表3)。CT829537-RNAi的转基因水稻根部及其培养液中总酚含量均低于野生型水稻, CT829537-OE的转基因水稻则高于野生型水稻。通过检测3种水稻的根系和培养液中总酚含量显示, OsMYB (CT829537)能够调控化感水稻的总酚合成。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 稗草共培养处理对转基因水稻和野生型水稻的总酚含量影响 Table 3 Comparison of total phenol content between transgenic PI312777 and WT under rice/BYG co-cultured condition 处理 Treatment 供试材料 Experimental materials 根系总酚含量 Total phenol content in root (μ mol g-1) 水培液总酚含量 Total phenol content in culture solution (μ mol L-1) 与稗草共培 Co-cultured with BYG WT 19.69 a 24.17 b CT829537-RNAi 15.20 b 13.74 d CT829537-OE 20.28 a 26.90 a 无稗草共培 Without BYG WT 15.21 b 14.20 d CT829537-RNAi 13.52 c 13.18 d CT829537-OE 16.92 b 20.88 c Values followed by different small letters within a column are significantly different at the 0.05 level. Abbreviations are the same as those given in Fig. 1 同列不同小写字母表示差异显著(P< 0.05)。缩写同图1。

表3 稗草共培养处理对转基因水稻和野生型水稻的总酚含量影响 Table 3 Comparison of total phenol content between transgenic PI312777 and WT under rice/BYG co-cultured condition

从图5可以看出, CT829537-OE转基因水稻根系分泌物对稗草干重的抑制率达36.7%, 显著高于野生型植株, 后者根系分泌物的抑草潜力为30.08%。而CT829537-RNAi转基因水稻的化感作用最弱, 仅为16.4%。

图5

Fig. 5

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	图5 转基因PI312777及野生型PI312777的根系分泌物对稗草干重的抑制率 缩写同图1。a、b、c表示不同处理之间存在显著差异(P< 0.05)。Fig. 5 Inhibitory rates of root exudates from transgenic PI312777and WT on dry weight of BYG Abbreviations are the same as those given in Fig. 1. Superscript letters indicate statistical groups that are significantly different (P< 0.05).