以郑麦366、周麦18、邯郸6172和偃展4110作母本、以中国普通小麦微核心种质^[12]中的60余份材料作父本配制杂交组合, 再以这4份材料为轮回亲本回交2~3代, 自交4~5代, 通过表型选择, 形成4个亲本的优异性状的选择导入系群体, 分别定名为ZM366-ILs (70份)、ZM18-ILs (136份)、HD6172- ILs (59份)和YZ4110-ILs (24份), 共计289个品系。于2012年和2013年秋, 在中国农业科学院河南新乡试验基地按小区种植所有品系, 2次重复。小区面积8.0 m × 1.2 m = 9.6 m², 行距25 cm; 小区播种量为0.25 kg, 均采用Wintersteriger Plotseed TC (奥地利)播种。

1.2.1 冠层温度 自开花期开始, 选择晴朗无风少云的天气, 于13:00至15:00, 采用雷泰ST20型(美国)手持式红外测温仪测定冠层温度, 每7 d测定一次。光谱通带为8~14 m, 其灰度值为0.95。为消除太阳方位角和种植方向对观测值的影响, 测定时仪器探棒沿小区种植走向, 在高于小麦冠层20 cm与冠层呈30° 夹角处测量长势均匀的部位, 避免红外线照射裸露地面。每小区测3次, 取平均值作为该次测定的冠层温度值。

1.2.2 旗叶叶绿素含量 在测定冠层温度的同时, 采用SPAD-502叶绿素仪(日本)测定289份导入系的旗叶叶绿素含量(相对值), 选取旗叶中部(避开叶脉)测量, 测量面积为2 mm × 3 mm, 厚度不超过1.2 mm, 深度滑块(depth stop)可以使被测叶片放入的深度保持一致。每份材料测10次, 取平均值。

1.2.3 产量及其相关性状 成熟期调查单位面积穗数、株高, 每个小区随机取20个单株考察穗粒数。用Wintersteriger小区收割机(奥地利)分小区收获计产, 折合成公顷产量。从每小区随机取500粒称量, 重复4次, 计算千粒重。

选取与穗粒数和千粒重平均值显著关联的44个SSR位点^{[13, 14]}, 参考Wang等^[13]描述的方法进行PCR扩增及基因型数据读取。

为了分析材料间遗传协方差程度, 用SPAGeDi软件^[15]分析基因型数据, 构建材料间亲缘关系矩阵。根据Loiselle等^[16]提出的方法, 采用10 000次排列测验来计算材料间的共祖系数。如果2个材料间的值为0, 说明这2份材料无关^[17]。为了降低关联分析的假阳性比率, 首先采用STRUCTURE3.0软件^{[18, 19]}分析所有材料的群体结构。选取分布于小麦21条染色体上的42对不连锁的SSR标记, 估计全部材料的群体结构。参数burn-in period为50 000次迭代次数, Markov Chain Monte Carlo (MCMC)为500 000次重复^[13]。

采用TASSEL 2.1软件中同时考虑群体结构和亲缘关系(Q+K)的混合线性模型(MLM), 对选择导入系进行组关联分析, 并计算优异等位变异的相对贡献率^{[13, 14]}。

冬小麦冠层温度在基因型间存在显著差异, 同一材料重复间差异显著, 说明冠层温度受基因型和生长环境共同影响, 并且两者存在一定程度的互作(表1)。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 冠层温度的方差分析 Table 1 Analysis of variance on canopy temperature (CT) 变异来源 Source 平方和 SS 自由度 df 均方 MS F值 F-value P值 P-value 基因型 Genotype (G) CT6/5 378.925 217 1.746 13.536 < 0.001 CT13/5 1261.062 217 5.811 15.745 < 0.001 CT20/5 442.335 217 2.038 11.232 < 0.001 CT26/5 2090.853 217 9.636 49.973 < 0.001 重复 Repetition (R) CT6/5 145.931 3 48.644 377.062 < 0.001 CT13/5 1497.261 3 499.087 1352.184 < 0.001 CT20/5 628.063 3 209.354 1153.615 < 0.001 CT26/5 323.514 30 107.838 559.268 < 0.001 基因型× 重复 G× R CT6/5 749.172 544 1.377 10.675 < 0.001 CT13/5 4399.499 544 8.087 21.811 < 0.001 CT20/5 1691.906 544 3.110 17.138 < 0.001 CT26/5 2748.784 544 5.053 26.205 < 0.001 误差 Error CT6/5 191.447 1484 0.129 CT13/5 547.740 1484 0.369 CT20/5 269.312 1484 0.181 CT26/5 286.145 1484 0.193

表1 冠层温度的方差分析 Table 1 Analysis of variance on canopy temperature (CT)

4套选择导入系的冠层温度存在一定差异, 其中ZM18-ILs的冠层温度无论是在灌浆前期、还是中后期都显著低于其他3个导入系; YZ4110-ILs的冠层温度在灌浆前期及后期显著高于其余各系; ZM366-ILs和HD6172-ILs的冠层温度介于ZM18- ILs和YZ4110-ILs之间(表2)。同样, 4套选择导入系的叶绿素含量也存在差异, HD6172-ILs的叶绿素含量在灌浆前期显著低于其余各系; Z18-ILs的叶绿素含量较高, 尤其是在灌浆后期, 显著高于其余各系。比较产量及其构成因子, YZ4110-ILs的穗粒数显著低于其余各系; Z18-ILs的千粒重显著高于其余各系, 由于千粒重对产量具有重要作用, 因此, 使得Z18-ILs的单产显著高于其余各系(表2)。

4个时期的冠层温度与产量都呈负相关(表3)。灌浆初期, 冠层温度与产量呈不显著的负相关, 随后呈显著或极显著负相关, 并且相关系数随灌浆进程逐渐增大。冠层温度与千粒重也呈负相关关系, 并且变化趋势同冠层温与产量的关系, 但是冠层温度与千粒重的相关程度更高。与此相反, 冠层温度与单株有效穗数表现正相关, 灌浆初期相关性不显著, 随着时间的推移, 两者间的相关系数逐渐增大, 并达到显著或极显著水平。冠层温度与穗粒数之间相关不显著。

对4个时期所测得的冠层温度和叶绿素取平均值后, 进一步分析了冠层温度、叶绿素含量和千粒重三者间的关系, 回归分析显示, 冠层温度与叶绿素含量及千粒重均呈极显著负相关。即品种的冠层温度越低, 该品种的叶绿素含量则相对较高, 最终品种的千粒重也较高(图1)。说明较低的冠层温度对叶绿素及光合系统起着保护作用, 从而保证后期的光合作用, 保障灌浆中后期籽粒的充实。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 4套选择导入系(ZM366-Ils、ZM18-Ils、HD6172-ILs和YZ4110-ILs)间表型变异的比较 Table 2 Phenotypic comparison among SIL lines in genetic background of Zhenmai 366 (ZM366-ILs), Zhoumai 18 (ZM18-ILs), Handan 6172 (HD6172-ILs), and Yanzhan 4110 (YZ4110-ILs) 性状 Trait ZM366系 ZM366-Ils Z18系 Z18-Ils HD6172系 HD6172-Ils YZ4110系 YZ4110-Ils 总体 Total CT6/5(℃) 24.94± 0.0513 24.09± 0.0311* 24.83± 0.0551 25.25± 0.1128* 24.78± 0.0283 CT13/5(℃) 23.67± 0.0635 23.13± 0.0881* 23.55± 0.1145 24.73± 0.2326* 23.77± 0.0513 CT20/5(℃) 24.58± 0.0693 23.71± 0.0452* 24.46± 0.0479 24.80± 0.1205 24.39± 0.0301 CT26/5(℃) 28.97± 0.0967 27.21± 0.0595* 28.07± 0.1413 29.06± 0.2206 28.33± 0.0684 CC4/5 55.57± 0.2329 54.62± 0.2601 53.22± 0.2463 55.08± 0.4267 54.65± 0.1438 CC11/5 56.03± 0.2288 55.61± 0.2259 54.25± 0.2628 56.12± 0.3622 55.52± 0.1304 CC18/5 51.45± 0.3202 53.32± 0.2441* 50.94± 0.2887 49.12± 0.7031 52.08± 0.1766 CC24/5 40.55± 0.4419 46.55± 0.4066* 43.34± 0.6083 40.10± 1.6155 43.88± 0.3212 单株有效穗数 Spike number per plant 7.60± 0.0893 7.30± 0.0607 7.60± 0.0731 7.90± 0.1620 7.50± 0.0422 穗粒数 Grain number 37.90± 0.2463 37.30± 0.3028 37.00± 0.4240 34.10± 0.7045* 36.90± 0.1980 千粒重 1000-kernel weight (g) 40.22± 0.3309 45.68± 0.3037* 41.75± 0.4678 41.44± 0.5596 42.66± 0.2547 产量 Yield (kg hm-2) 9060± 89.6850 9765± 55.7970 9105± 81.0255 8940± 114.5475 9300± 46.1250 * 表示与其他选择导入系群体间差异显著。* Significant difference with other SIL lines at the 0.05 level.

表2 4套选择导入系(ZM366-Ils、ZM18-Ils、HD6172-ILs和YZ4110-ILs)间表型变异的比较 Table 2 Phenotypic comparison among SIL lines in genetic background of Zhenmai 366 (ZM366-ILs), Zhoumai 18 (ZM18-ILs), Handan 6172 (HD6172-ILs), and Yanzhan 4110 (YZ4110-ILs)

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 冠层温度与产量及构成因子间的关系 Table 3 Correlation coefficients between canopy temperature (CT) and yield and its component factors 冠层温度 Canopy temperature 产量 Yield 千粒重 Thousand-kernel weight 穗粒数 Grain number per spike 单株有效穗数 Spike number per plant CT6/5 -0.085 -0.107 -0.101 0.087 CT13/5 -0.173* -0.207* -0.098 0.193* CT20/5 -0.221* * -0.332* * -0.008 0.246* CT26/5 -0.386* * -0.502* * 0.129 0.350* * * 在P< 0.05水平显著; * * 在P< 0.01水平显著。* Significant at P< 0.05; * * Significant at P< 0.01.

表3 冠层温度与产量及构成因子间的关系 Table 3 Correlation coefficients between canopy temperature (CT) and yield and its component factors

图1

Fig. 1

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图1 冠层温度与叶绿素含量(CC)、千粒重(TKW)间的关系(2013)Fig. 1 Correlations between chlorophyll content (CC), thousand-kernel weight (TKW), and canopy temperature (CT) in 2013

利用44个与穗粒数或千粒重相关联的SSR位点对全套材料扫描, 共检测到9个SSR位点与冠层温度显著关联(P< 0.01)。其中, 有4个位点在3个时期都能被检测到关联, 占关联位点的44.5%; 有3个位点在2个时期被检测到关联, 占关联位点的33.3%; 另2个位点仅在1个时期被检测到关联, 占关联位点的22.2%。这9个位点中, 5个位点同时与穗粒数和千粒重相关联, 另2个位点与千粒重显著关联, 占关联位点的77.8% (表4)。在9个关联位点中, 6个位点上检测到优异等位变异, 携带优异等位变异材料的冠层温度显著低于携带非优异等位变异材料的冠层温度(图2)。

图2

Fig. 2

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图2 关联位点上优异等位变异的表型效应 * 表示携带优异等位变异材料的冠层温度显著低于携带非优等位变异材料的冠层温度。Fig. 2 Phenotypic effect of favored alleles at loci associated with canopy temperature * Canopy temperatures of accessions contained favored alleles were significantly lower than those contained unfavored alleles.

优异等位变异在导入系中的分布, 以Xgwm 234_229和Xgwm46_180的频率最高, 其次是Xgwm 275_108、Xgwm609_111和Xwmc24_131, Xwmc17_ 184的频率较低(图3)。4个导入系中, 以ZM8-ILs包含的优异等位变异数量最多, 并且各个优异等位变异在该选择导入系中的频率也都较高; HD6172- ILs包含的优异等位变异数量其次; YZ4110-ILs再次; 而ZM366-ILs携带的优异等位变异数最少, 且各个优异等位变异在该导入系中的频率也较低(图3)。同时发现, 在4个检测时期, 随着导入系材料包含优异等位变异数量的增加, 其冠层温度呈降低趋势(图4)。

图3

Fig. 3

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图3 优异等位变异在选择导入系中的频率分布Fig. 3 Distribution of favored alleles in selected introgression lines

图4

Fig. 4

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图4 冠层温度与优异等位变异数之间的关系Fig. 4 Correlations between canopy temperature and number of favored alleles at different stage

4套导入系的叶绿素含量存在明显差异, 尤其是后期的叶绿素含量(表2)。用上述44个与穗粒数或千粒重相关的SSR位点与叶绿素含量的关联分析发现, 20个位点与其呈现不同程度的关联(表5)。非常有趣的是与冠层温度关联的9个位点均在其中, 并多与灌浆后期的叶绿素含量关联(表4和表5)。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 与不同灌浆时期冠层温度显著关联的SSR位点 Table 4 Loci associated with canopy temperatures at different grain filling stages 位点 Locus 染色体Chromosome 位置 Position (cM) 优异等位变异 Favored allele (bp) 关联性状 Associated trait Xwmc24 1A 37.40 131 CT6/5, CT13/5, CT26/5 GN, TKW Xgwm275 2A 56.12 108 CT6/5, CT20/5 GN, TKW Xgwm156 3B 40.05 CT6/5, CT20/5, CT26/5 GN, TKW Xgwm609 4D 115.7 111 CT15/5, CT20/5, CT26/5 GN, TKW Xgwm234 5B 20.57 229 CT26/5 TKW Xwmc415 5B 61.29 CT13/5, CT26/5 GN, TKW Xbarc322 5D 74.78 CT13/5 Xwmc17 7A 89.17 184 CT6/5, CT26/5 TKW Xgwm46 7B 41.00 180 CT6/5, CT13/5, CT20/5 CT: canopy temperature, the figures afterwards indicate the sampling date (day/month); GN: grain number per spike; TKW: 1000- kernel weight. CT: 冠层温度, 右下角数字表示测定日期(日/月); GN: 穗粒数; TKW: 千粒重。

表4 与不同灌浆时期冠层温度显著关联的SSR位点 Table 4 Loci associated with canopy temperatures at different grain filling stages

表5

Table 5

表5(Table 5)

表5 与不同灌浆时期叶绿素含量显著关联的SSR位点 Table 5 Loci associated with chlorophyll content at different grain filling stages 关联位点 Locus 染色体 Chromosome 位置 Pos. (cm) 优异等位变异 Favored allele (bp) 关联性状 Associated trait Xwmc24 1A 37.40 131 CC4/5, CC11/5, CC18/5, CC24/5 GN, TKW Xgwm268 1B 75.20 CC4/5, CC11/5 GN Xgwm259 1B 105.70 CC4/5, CC11/5, CC18/5 TKW Xgwm275 2A 56.12 108 CC4/5, CC11/5, CC18/5, CC24/5 GN, TKW Xgwm249 2A 58.72 CC11/5 Xgwm312 2A 79.26 CC11/5 TKW Xgwm372 2A 80.45 CC24/5 Xwmc361 2B 108.21 CC4/5 Xgwm2 3A 72.00 CC18/5 Xgwm156 3B 40.05 311 CC4/5, CC11/5, CC24/5 GN, TKW Xgwm609 4D 115.70 111 CC4/5, CC11/5, CC24/5 GN, TKW Xgwm234 5B 20.57 229 CC4/5, CC11/5, CC18/5 TKW Xwmc415 5B 61.29 CC11/5, CC18/5 GN, TKW Xcfd52 5D 62.40 CC18/5 GN Xbarc322 5D 74.78 CC24/5 Xgwm55 6D 83.45 130 CC4/5, CC18/5 GN Xgwm471 7A 1.00 135 CC4/5, CC24/5 GN Xwmc17 7A 89.17 184 CC18/5, CC24/5 TKW Xgwm46 7B 41.00 180 CC11/5, CC18/5, CC24/5 Xbarc258 7B 70.31 275 CC4/5, CC24/5 Loci associated with canopy temperature are in bold italics. CC: chlorophyll contents with subscript sampling date (day/month); GN: grain number per spike; TKW: 1000-kernel weight. 加粗体表示与冠层温度关联的位点; CC: 叶绿素含量, 右下角数据表示测定日期(日/月); GN: 穗粒数; TKW: 千粒重。

表5 与不同灌浆时期叶绿素含量显著关联的SSR位点 Table 5 Loci associated with chlorophyll content at different grain filling stages

冠层温度的测定具有快速、简单的特点, 已成为高通量表型鉴定的一个重要性状指标。很多研究者对冬小麦籽粒花后期冠层温度动态变化与产量性状之间的关系进行了研究, 发现冠层温度作为高产指标的条件取决于品种生长的环境^[3]。在灌溉条件下, 春小麦的冠层温度与产量及其构成因子间呈显著负相关^{[4, 5]}; 冠层温度主要与春小麦的产量和穗数呈显著相关, 并提出可应用冠层温度进行高产潜力品种的选择^[6]。大量研究表明, 灌浆期间的冠层温度可有效地反映小麦产量的遗传类型, 其中开花后两周内的冠层温度更能反映不同基因型春小麦的产量潜力^{[7, 8]}。李向阳等^[20]对小麦冠温和产量的关系探讨发现, 在河南省的生态条件下, 小麦灌浆期间的冠层温度与小麦产量及其主要构成因素大部分呈负相关。徐银萍等^[21]报道, 冬小麦产量与灌浆过程中的冠层温度呈显著负相关, 且随着灌浆进程, 相关性增大。由此可见, 冠层温度可以作为产量潜力的间接选择指标^[22]。多数研究认为, 不同基因型小麦的冠气温差和产量显著相关^{[23, 24]}, 如李向阳等^[25]研究发现, 无论是强势粒还是弱势粒的灌浆速率, 冷尾小麦豫麦50均大于暖尾小麦豫麦34和豫麦70。然而, 也有研究发现, 在水分胁迫条件下, 当土壤含水量是小麦产量的主要限制因子时, 冠层温度与产量相关不显著^{[26, 27]}。本研究利用289份选择导入系, 连续两年度考察自开花至成熟4个时期的冠层温度与产量及其构成因子间的关系, 发现冠层温度与产量、千粒重、穗粒数和单株有效穗数显著相关, 且随着灌浆进程, 相关性逐渐增大, 获得与前人研究一致的结论: 高产基因型无论是在水分充足的条件下, 还是在水分胁迫条件下, 均表现较低冠层温度, 小麦冠层温度因基因型而异, 尤其是在小麦抽穗至成熟期间更为明显。本课题组多年系统观察表明, 不同类型小麦冠层的高、低温特性相当稳定, 不因年份的更替和天气的变化而变化, 因此认为, 冠层温度可以作为优异种质筛选的简易指标, 本研究结果进一步表明, 灌浆中后期或末期的冠层温度更适合作为优异种质筛选的指标之一。

本研究结果显示, 叶绿素含量与千粒重和产量显著正相关, 随着灌浆进程, 两者间的相关性逐渐增大, 高产(超高产)品种在生育后期都具有较高的叶绿素含量和光合速率、以及较大的光合叶面积指数和较高的PSII最大光化学效率, 并且旗叶可溶性糖和可溶性蛋白含量不仅高而且下降缓慢, 使得叶片的光合功能期延长^{[28, 29]}。李永攀等^[30]研究表明, 持绿型小麦品种抗衰老, 光合作用时间长, 籽粒充实, 千粒重提高。本研究中周麦18选择导入系群体的产量显著高于其他3套导入系, 其在在灌浆末期, 表现出显著低的冠层温度和显著高的叶绿素含量, 表明在灌浆期能维持较高的光合生产能力, 通过热量耗散的增加来保护叶片不受强光的伤害, 就能延迟叶片的衰老, 使叶片维持较高的叶面积系数和叶绿素含量。

如前所述, 与冠层温度关联的位点均与灌浆中后期旗叶的叶绿素含量明显相关, 且对两性状而言, 优异等位变异存在高度的一致性, 它们又是与高千粒重关联的优异等位变异^{[13, 14]}, 说明灌浆后期, 良好的根系功能保证了水分和营养的正常供应, 降低了冠层温度, 对叶绿素和光合起到了良好的保护作用, 最终体现在千粒重和产量的增加。我们对4个轮回亲本(周麦18、偃展4110、郑麦366和邯郸6172)根系的观察证明了上述推测。因此灌浆中后期冠层温度可作为小麦根系大小、活力及产量潜力的重要选择指标应用于育种。

尽管小麦冠层温度无论在灌溉条件下, 还是在逆境胁迫条件下, 都显示出与产量存在显著关系, 但关于冠层温度的遗传机制研究相对较少。Reynolds等^[31]认为冠层温度是小麦基因型在特定环境下的遗传表现, 主要受光合有效辐射、气孔导度、空气温度和VPD等一系列生理生态因子的影响。Lopes等^[32]选取288份来自于世界各地的春小麦种质, 将其分别种植于北非、西亚、南亚等12个环境中, 发现基因型与环境间存在明显互作; 性状间的关系也与环境密切相关; 冠层温度表现为中等遗传力, 且在所有环境中均表现与产量负相关。申国安等^[33]于1997— 1999年用6个不同的材料配制成完全双列杂交, 研究表明, 小麦冠层温度有较高的遗传力, 比较稳定, 小麦冠层温度的遗传符合加性-显性遗传模型, 以加性效应为主, 呈部分显性, 低温型为显性或部分显性。Saint等^[34]也认为小麦冠层温度的遗传以加性效应为主, 但同时也存在显性和共显性的遗传模型, 且基因型与环境间存在明显互作。Rebetzke等^[35]研究显示, 冠层温度的遗传力约为0.75, 在3种环境中共检测到16个影响冠层温度的QTL, 其中部分QTL与控制株高和植株形态发育等的QTL相重叠。本研究以高世代选择导入系群体为试验材料, 利用关联分析法一次性检测到比前人更多的影响冠层温度的位点, 与前人已定位到的QTL相比, 一部分定位结果相一致或位于其区间附近, 此外, 还检测到新的QTL。并且本研究所检测到的关联位点中, 有近一半在整个小麦灌浆期都能被检测到关联, 因此, 我们推断这些位点可能对叶片的蒸腾作用及叶片的衰老起重要作用。同时, 这9个位点全部与穗粒数和千粒重同时显著关联^{[13, 14]}。另外, 这9个与冠层温度显著关联的位点中, 有8个还与叶绿素含量同时显著关联, 推测一因多效或基因间的紧密连锁可能是同一个标记位点与多个性状相关联或性状相关的遗传基础。