71份材料为近年来在黄淮海地区推广种植的主要小麦品种, 其中11份来自北部冬麦区, 60份来自黄淮冬麦区。这些材料绝大多数都是该区推广面积较大的主导品种, 有18个品种的年最大推广面积超过66.7万公顷。

2009— 2010年小麦生长季, 在河北省农林科学院遗传生理研究所试验田(石家庄)进行抗寒性鉴定, 行长1 m, 行距25 cm; 每个材料种2行, 每行均匀点播30粒种子; 2个重复。2009年10月8日播种, 2010年3月16日至17日调查冻害发生严重度, 分为无冻害(1级); 叶尖受冻发黄干枯, 少数植株叶片枯萎(2级); 大部分植株叶片枯萎, 但无植株冻死, 基部仍有绿色(3级); 叶片全部枯萎, 小于50%植株冻死(4级); 叶片全部枯萎, 大于50%植株冻死(5级); 地上全部枯萎, 植株全部冻死(6级)。

利用酚-氯仿法^[18]提取小麦幼苗DNA, 每个材料提取2份DNA, 分别用于基因型分析。根据文献提供的序列信息, 由北京澳科生物技术有限责任公司合成相关引物(表1)。PCR体系为15 μ L, 包含1× buffer、2.5 mmol L^-1 Mg²⁺、每条引物0.25 μ mol L^-1引物、dNTP各0.2 mmol L^-1、Taq DNA聚合酶0.75 U、模板DNA 40~60 ng。PCR扩增程序为95℃预变性5 min; 95变性30 s, 退火30 s, 72℃延伸30~90 s, 36个循环; 72℃延伸5 min。用2.0%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物, 采用0.5× TBE缓冲体系, 120 V恒压电泳。凝胶成像照相。

利用SPSS 19.0软件对71个品种的抗寒性与其VRN1基因型进行简单相关性分析。

2009— 2010年度是我国小麦发生冬季冻害的重灾年份, 黄淮海地区小麦普遍较往年提前15~20 d进入越冬期, 随后出现大范围降雪和持续低温天气。试验材料冻害十分严重, 品种间差异明显。其中46.5%的品种发生了较为严重的冻害(冻害≥ 4级), 26.8%的品种植株冻死率达50%以上, 豫麦50、郑麦9023、皖麦48、徐州21和西农1376等5个品种冻死率达100%。在年最大种植面积超过66.7万公顷的18个品种中, 有11个冻害达到4级以上。北部冬麦区品种的抗寒性普遍较好, 11个品种基本没发生植株冻死的现象。邯6172、烟农19、豫麦18等在黄淮冬麦区长期推广面积较大的品种也表现出较好的抗性, 其冻害均为3级。冻害为6级的品种皆为审定推荐在黄淮冬麦区南片种植的品种, 黄淮冬麦区南片品种冻害均大于2级(表2)。

在VRN-A1位点, 仅晋麦47和西农1376具有显性等位基因Vrn-A1b, 未发现具Vrn-A1a的品种; 进一步检测, 发现这些品种也都不具有显性等位基因Vrn-A1c。引物对361S-F与VA1-R和引物对361W-F与VA1-R检测出鲁麦15、鲁麦22、鲁麦23、豫麦18、郑麦9023、洛旱6号、皖麦48、徐麦21、西农979、西农1376具有显性等位基因Vrn-A1, 而其他品种为vrn-A1基因型(图1和表2)。

在VRN-B1位点, 除郑麦9023为Vrn-B1基因型外, 其他70个品种均为vrn-B1基因型(表2)。

在VRN-D1位点, 石4185、衡观35、泰山23、豫麦18、偃展4110、皖麦48、徐州21、西农1376等18个品种具有显性等位基因Vrn-D1, 其他品种具有隐性等位基因vrn-D1(表2)。

从VRN1基因的检测结果看, 北部冬麦区11个品种的基因型均为vrn-A1vrn-B1vrn-D1, 3个位点均为隐性等位基因。黄淮冬麦区品种在3个位点均存在显性等位变异, 其中Vrn-D1基因出现的频率最高, 为25.7%, 其次是Vrn-A1和Vrn-B1, 分别为15.7%和1.4%。其中, 显性基因Vrn-A1基本为361S-F与VA1-R引物对检测到的。在71个实验材料中, 只有郑麦9023同时具有显性等位基因Vrn-A1和Vrn-B1, 豫麦18、西农1376、皖麦48和徐州21等4个品种同时具有Vrn-A1和Vrn-D1两个显性等位基因, 基因型为Vrn-B1Vrn-D1和Vrn-A1Vrn- B1Vrn-D1的品种均未出现。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 VRN-A1、VRN-B1和VRN-D1基因型分析所用引物 Table 1 PCR markers for detecting the alleles of VRN-A1, VRN-B1, and VRN-D1 位点 Locus 引物组合 Primer pair 引物序列 Sequence (5'-3') 等位基因 Allele 目标片段 Product size (bp) 退火温度 Annealing temp. (℃) 参考文献 Reference VRN-A1 VRN1AF VRN1-INT1R GAAAGGAAAAATTCTGCTCG GCAGGAAATCGAAATCGAAG Vrn-A1a 965 + 876 50 Yan et al. [15] Vrn-A1b 714 Vrn-A1c 734 vrn-A1 734 Intr1/A/F2 AGCCTCCACGGTTTGAAAGTAA Vrn-A1c 1170 56 Fu et al. [16] Intr1/A/R3 AAGTAAGACAACACGAATGTGAGA Intr1/C/F GCACTCCTAACCCACTAACC vrn-A1 1068 58 Fu et al. [16] Intr1/AB/R TCATCCATCATCAAGGCAAA 361S-F AAGCCCGTTATATCACCTTA VrnA1 469 55 Sherman et al. [17] VA1-R GATGTGGCTCACCATCCACG 361W-F AAGCCCGTTATATCACCTTT vrnA1 469 55 Sherman et al. [17] VA1-R GATGTGGCTCACCATCCACG VRN-B1 Intr1/B/F CAAGTGGAACGGTTAGGACA Vrn-B1 709 58 Fu et al. [16] Intr1/B/R3 CTCATGCCAAAAATTGAAGATGA Intr1/B/F CAAGTGGAACGGTTAGGACA vrn-B1 1149 55 Fu et al. [16] Intr1/B/R4 CAAATGAAAAGGAATGAGAGCA VRN-D1 Intr1/D/F GTTGTCTGCCTCATCAAATCC Vrn-D1 1671 65 Fu et al. [16] Intr1/D/R3 GGTCACTGGTGGTCTGTGC Intr1/D/F GTTGTCTGCCTCATCAAATCC vrn-D1 997 63 Fu et al. [16] Intr1/D/R4 AAATGAAAAGGAACGAGAGCG

表1 VRN-A1、VRN-B1和VRN-D1基因型分析所用引物 Table 1 PCR markers for detecting the alleles of VRN-A1, VRN-B1, and VRN-D1

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 71个小麦品种的抗寒性及VRN1基因组成 Table 2 Cold hardiness and VRN1alleles of 71 wheat varieties 品种 Variety 冻害 Freezing injury VRN-A1 VRN-B1 VRN-D1 麦区 Wheat region 沧6002 Cang 6002 1 R R R I 中麦11 Zhongmai 11 2 R R R I 中麦12 Zhongmai 12 2 R R R I 京411 Jing 411 3 R R R I 京冬8号 Jingdong 8 3 R R R I 京冬17 Jingdong 17 3 R R R I 京9428 Jing 9428 3 R R R I 中麦9号 Zhongmai 9 3 R R R I 中麦175 Zhongmai 175 3 R R R I 邯4564 Han 4564 3 R R R I 石新616 Shixin 616 3 R R R I 济南17 Jinan 17 3 R R R II 鲁麦14 Lumai 14 3 R R R II 烟农19 Yannong 19 3 R R R II 烟农21 Yannong 21 3 R R R II 洛旱2号 Luohan 2 3 R R R II 洛旱6号 Luohan 6 3 D* R R II 晋麦47 Jinmai 47 3 D# R R II 金禾9123 Jinhe 9123 4 R R D II 衡观35 Hengguan 35 5 R R D II 冀麦38 Jimai 38 2 R R R II-N 石麦15 Shimai 15 2 R R R II-N 藁城8901 Gaocheng 8901 2 R R R II-N 中麦155 Zhongmai 155 3 R R R II-N 科农199 Kenong 199 3 R R D II-N 邯6172 Han 6172 3 R R R II-N 石家庄8号 Shijiazhuang 8 3 R R R II-N 石新828 Shixin 828 3 R R D II-N 藁优2018 Gaoyou 2018 3 R R R II-N 衡4399 Heng 4399 3 R R R II-N 邢麦6号 Xingmai 6 3 R R R II-N 山农17 Shannong 17 3 R R R II-N 石4185 Shi 4185 4 R R D II-N 邯7086 Han 7086 4 R R R II-N 鲁麦22 Lumai 22 4 D* R R II-N 鲁麦23 Lumai 23 4 D* R R II-N 济麦19 Jimai 19 4 R R R II-N 济麦22 Jimai 22 4 R R R II-N 舜麦1718 Shunmai 1718 4 R R R II-N 师栾02-1 Shiluan 02-1 5 R R R II-N 石麦18 Shimai 18 5 R R D II-N 鲁麦15 Lumai 15 5 D* R R II-N 济麦20 Jimai 20 5 R R R II-N 泰山23 Taishan 23 5 R R D II-N 良星99 Liangxing 99 5 R R D II-N 山农20 Shannong 20 3 R R R II-S 豫麦18 Yumai 18 3 D* R D II-S 周麦18 Zhoumai 18 3 R R R II-S 新麦9号 Xinmai 9 3 R R R II-S 新麦18 Xinmai 18 3 R R R II-S 新麦26 Xinmai 26 3 R R R II-S 皖麦52 Wanmai 52 3 R R R II-S 淮麦25 Huaimai 25 3 R R D II-S 郑麦7698 Zhengmai 7698 4 R R R II-S 周麦16 Zhoumai 16 4 R R R II-S 矮抗58 Aikang 58 4 R R R II-S 宿553 Su 553 4 R R R II-S 小偃22 Xiaoyan 22 4 R R R II-S 郑麦004 Zhengmai 004 5 R R D II-S 郑麦366 Zhengmai 366 5 R R R II-S 周麦12 Zhoumai 12 5 R R D II-S 周麦22 Zhoumai 22 5 R R R II-S 偃展4410 Yanzhan 4410 5 R R D II-S 泛麦5号 Fanmai 5 5 R R D II-S 许科1号 Xuke 1 5 R R D II-S 西农979 Xinong 979 5 D* R R II-S 豫麦50 Yumai 50 6 R R R II-S 郑麦9023 Zhengmai 9023 6 D* D R II-S 皖麦48 Wanmai 48 6 D* R D II-S 徐州21 Xuzhou 21 6 D* R D II-S 西农1376 Xinong 1376 6 D#* R D II-S Varieties in bold have the maximum annual area more than 667 000 ha according to Wheat Variety Improvement and Pedigree in China [36] and the National Statistics for Main Crop Variety Extension edited by the National Agricultural Technology Extension and Service Center. R: recessive allele; D: dominant allele; D#: Vrn-A1b; D* : Vrn-A1 detected by primer pair 361S-F and VA1-R. Wheat regions I and II stand for Northern Winter Wheat and Yellow-Huai River Valley Winter Wheat zones, respectively; regions II-N and II-S stand for the northern and southern parts of region II, respectively. 加粗体品种表示年最大推广面积超过66.7万公顷, 信息来自《中国小麦品种改良及系谱分析》[19]和全国农业技术推广服务中心主编的《全国农作物主要品种推广统计表》。R: 隐性; D: 显性; D#: Vrn-A1b; D* : VRN-A1位点为361S-F与VA1-R引物对检测出的等位基因Vrn-A1。麦区I和II分别表示北部冬麦区和黄淮冬麦区, II-N和II-S分别表示黄淮冬麦区北片和南片。

表2 71个小麦品种的抗寒性及VRN1基因组成 Table 2 Cold hardiness and VRN1alleles of 71 wheat varieties

图1

Fig. 1

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图1 引物对361W-F与VA1-R、361S-F与VA1-R检测部分品种VRN-A1位点电泳图谱 M: 100 bp DNA ladder; 1: 邯6172; 2: 衡观35; 3: 中麦9号; 4: 京冬8号; 5: 烟农19; 6: 泰山23; 7: 济麦22; 8: 鲁麦23; 9: 徐麦21; 10: 豫麦18; 11: 郑麦9023; 12: 矮抗58; 13: 周麦22; 14: 西农979。Fig. 1 Allelic variation at VRN-A1 locus detected by premier pairs 361W-Fand VA1-R, and 361S-Fand VA1-R M: 100 bp DNA ladder; 1: Han 6172; 2: Hengguan 35; 3: Zhongmai 9; 4: Jingdong 8; 5: Yannong 19; 6: Tanshan 23; 7: Jimai 22; 8: Lumai 23; 9: Xuzhou 21; 10 Yumai 18; 11: Zhengmai 9023; 12: Aikang 58; 13: Zhoumai 22; 14: Xinong 979.

VRN1基因对小麦品种抗寒性的作用明显, 抗寒性好的品种(冻害≤ 3级)在Vrn-A1、Vrn-B1、Vrn-D1这3个位点都为隐性基因的占84.2%。其中, 冻害为1级和2级的品种基因型全部为vrn-A1vrn-B1vrn-D1基因型; 冻害为3级的32个品种中, 有26个在3个位点均为隐性基因。北部冬麦区的11个品种, 基因型均为vrn-A1vrn-B1vrn-D1, 冻害均≤ 3级。基因型vrn-A1vrn-B1vrn-D1与品种冻害显著相关, 相关系数为-0.945 (P< 0.01)。冻害为5级和6级的19个品种中, 除师栾02-1、济麦20、郑麦366、豫麦50外, 其他品种至少在VRN1位点存在1个显性基因。具有2个显性VRN1基因的品种, 除豫麦18外, 冻害均为最严重的6级。在冻害为6级的5个品种中, 除豫麦50外均具有2个显性VRN1基因。

从VRN1基因的组成与品种的抗寒性看, VRN-A1对小麦品种抗寒性的影响大于VRN-D1。在具有显性基因Vrn-A1的品种中, 36.4%冻害为6级, 而只有16.7%具有Vrn-D1的品种冻害达到6级。

作物的抗逆性状都是典型的数量性状, 都存在着复杂的遗传调控网络。研究结果显示小麦抗寒性与其他抗逆性状的遗传网络存在着部分重叠, 具有较好耐盐碱、抗旱、耐旱节水、抗高温干热风等特性的品种多表现出较好的抗寒性。本试验中抗寒性表现最好的沧6002, 同时已被生产和国家区域试验鉴定证实是一个抗旱性、耐盐碱性都好的品种; 另外5个抗寒性表现突出的品种, 除藁城8901外也均是在国家区域试验和生产中抗逆特性表现较好的品种。洛旱2号、洛旱6号、晋麦47、石麦15、烟农21、中麦11等审定为节水抗旱的品种都具有较好的抗寒性, 周麦18、新麦26、皖麦52、淮麦25、冀麦38、科农199、石新828、中麦12等在生产中表现具有一定耐旱等抗逆特性的品种其冻害也都小于3级, 其中包含科农199、石新828、洛旱6号、淮麦25、晋麦47等具有VRN1显性基因的品种。

对小麦抗逆相关生理、生化性状关系的研究也证实抗寒性与其他抗逆性状遗传网络的重叠。研究显示, 在小麦低温胁迫与抗寒锻炼过程中, 同其他非生物胁迫一样, 参与植株渗透调节有关的可溶性糖类、可溶性蛋白和脯氨酸等的含量在抗寒性强的品种中较抗寒性弱的品种有较大幅度提高^{[20, 21, 22]}; 增加生物膜稳定性的不饱和脂肪酸在抗寒性强的品种中的含量较抗寒性弱的品种有显著上升^[23], 而叶片的电导率、丙二醛含量则显著低于抗寒性弱的品种^{[22, 23, 24]}; 与生物抗氧化作用有关的谷胱甘肽还原系统的功能和SOD、POD、CAT等酶类的活性在抗寒性强的品种中显著增强^{[23, 24, 25]}; 与抗旱、耐盐碱等有关的生物激素ABA的含量在抗寒性强的品种中较抗寒性弱的品种有明显提高, 而GA的含量则明显降低^[26]。

有关黄淮海地区小麦品种VRN1基因型分析的研究较多, 数据显示, 黄淮海不同地区品种Vrn-A1、Vrn-B1和Vrn-D1基因出现的频率有所不同、而不同时期推广种植的品种具有这些显性基因的频率也会发生改变。但从整体上看, 这些研究同本文的研究都显示, Vrn-D1是该地区小麦品种中存在最多的VRN1显性基因, 而Vrn-A1和Vrn-B1出现的概率较小^{[27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34]}; 显性基因Vrn-A1基本为引物对361S-F与VA1-R所检测出^[35]。以往的研究偏重探讨VRN1基因型与小麦冬春性^{[29, 30, 31, 32, 33, 34, 35]}、抽穗期^[27]、开花期和成熟期^[28]等的关系, 并未对VRN1与抗寒性的关系展开直接研究。小麦的抗寒性与冬春性是两个有所关联但无必然联系的生物学性状, 冬性品种的抗寒性并不一定强, 而春性品种的抗寒性也不一定弱^[36]。半冬性品种师栾02-1、石麦18、泰山23等在本研究中都表现出较低的抗寒性, 而弱春性品种豫麦18则表现出相当强的抗寒性。

本研究支持FR1是VRN1一因多效的观点, VRN1应是小麦抗寒性遗传网络中的一个关键调控位点, vrn-A1vrn-B1vrn-D1基因型是小麦品种具有强抗寒性的必备条件。尽管试验中少数具有显性Vrn1基因的品种也表现较好的抗寒性, 一些具有vrn- A1vrn-B1vrn-D1基因型的品种也出现较严重冻害, 但冻害≤ 2级的品种基因型皆为vrn-A1vrn-B1vrn- D1, 对抗寒性要求更为严格的北部冬麦区11个品种(冻害均≤ 3级)的基因型也均为vrn-A1vrn-B1vrn- D1。具有显性Vrn1基因的品种, 除科农199、石新828、鲁麦15、鲁麦22、鲁麦23等少数品种在黄淮冬麦区北部推广种植外, 其他品种的适宜种植区皆为冬季气温较高的黄淮冬麦区南部。据全国农业技术推广服务中心的数据统计, 自2001年后年最大推广面积超过66.7万公顷的品种, 除主要在黄淮冬麦区南部推广的西农979, 和重点在黄淮冬麦区南部和长江中下游冬麦区推广的郑麦9023外, 郑麦366、矮抗58、周麦22、邯6172、烟农19、济麦19、济麦20、济麦22等其他品种在VRN1的3个位点的基因均为隐性。本研究中, 年最大推广面积超过66.7万公顷的18个品种, 除鲁麦15、鲁麦23、豫麦18、郑麦9023、徐州21和西农979具有Vrn1显性基因外, 均为vrn-A1vrn-B1vrn-D1基因型。这6个具有Vrn1基因的大品种, 多数在生产上都遭受过冻害危机。例如徐州21, 1988年的收获面积一度达到80.0万公顷, 但由于抗寒性差等原因, 播种区域迅速地被压缩到黄淮冬麦区南部的稻麦两熟区, 1992年的种植面积已下降到20.6万公顷 ^[19]。VRN-A1、VRN-B1和VRN-D1位点都是隐性基因型是保证品种具有强抗寒性、提高品种稳产性与适应性的提前条件。近年来, 具有显性基因Vrn1品种种植面积的扩大, 一方面反映了气候变暖对品种选育和利用的影响, 另一方面也是造成我国小麦主产区小麦冻害严重的主要原因。借助分子标记辅助选择技术, 选育、推广在VRN1 3个基因座均是隐性基因的品种, 是黄淮海北部地区小麦安全生产发展的必然抉择。

一些具有vrn-A1vrn-B1vrn-D1基因型的品种在试验中表现了较低的抗寒性, 这可能与2009— 2010年度石家庄市冬季残酷的气候条件致使小麦冻害偏重有关, 但某些品种如豫麦50 (冻害为6级)、小偃22 (冻害为4级)的冻害, 可能与它们不是当地适应的生态型, 品种的其他生育特性(如苗穗期短等)掩盖了其抗寒性表现有关。但在其适宜地区, 如豫麦50在河南信阳、小偃22在陕西关中, 均表现很好的抗寒性。