水稻抗白叶枯病新基因 Xa39分子标记有效性的评价
卓大龙1,2, 胡丹丹1,2, 张帆2, 张帆2,*, 石英尧1,*, 高用明2, 周永力2, 黎志康2
1安徽农业大学农学院, 安徽合肥 230036
2中国农业科学院作物科学研究所, 北京 100081
*通讯作者(Corresponding authors): 石英尧, E-mail: shiyy123@163.com, Tel: 0551-65786213; 张帆, E-mail: fzhang81@gmail.com

第一作者联系方式: E-mail: dalong9300@163.com, Tel: 13141269174

摘要

Xa39是一个对水稻白叶枯病具有广谱抗性的显性新基因, 在水稻抗白叶枯病育种中具有良好的应用价值和前景。在前期研究中, 我们将该基因定位在水稻第11染色体上。本研究利用携带 Xa39基因的供体亲本FF329与受体亲本BT4、BT6、BT12、BT18杂交培育出4FL10、4FL14、4FL17、4FL21四个育种F2分离群体, 结合人工接种抗病性鉴定, 对3个与 Xa39紧密连锁的分子标记进行分子标记辅助选择(MAS)有效性比较, 筛选高效的PCR分子标记。结果表明, 标记RM26985和RM206在上述4个群体中的MAS准确率分别达到95.81%和93.61%, 同时使用两者其准确率达到95.59%, 上述2个标记在水稻白叶枯病抗性改良育种中可以提高 Xa39的选择效率。

关键词: Xa39; 水稻白叶枯病; SSR; MAS
Evaluation of Selective Efficiency of Molecular Markers Linked with a Novel Gene Xa39 Resistant to Bacterial Blight in Rice
ZHUO Da-Long1,2, HU Dan-Dan1,2, ZHANG Fan2, ZHANG Fan2,*, SHI Ying-Yao1,*, GAO Yong-Ming2, ZHOU Yong-Li2, LI Zhi-Kang2
1College of Agronomy, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China
2Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China
Abstract

Xa39 is a novel and dominant resistance gene with broad spectrum for bacterial leaf blight in rice. In previous study, this gene was mapped on chromosome 11. In present study, FF329 carrying Xa39 gene as donor parent and BT4, BT6, BT12, BT18 as recipients were used to develop four F2 segregation populations (4FL10, 4FL14, 4FL17, 4FL21). Combining artificial inoculation with phenotype identification of bacterial leaf blight, the validity of three molecular markers tightly linked with Xa39, and two co-dominant molecular markers was investigated for marker-assisted selection (MAS). The results showed that the accuracy of marker RM26985 for MAS was 95.81% and that of marker RM206 was 93.61% in the four populations. The accuracy of two markers RM26985 and RM206 used simultaneously for MAS was up to 95.35%. Therefore, RM26985 and RM206 can be used as effective markers in MAS for Xa39in rice breeding program.

Keyword: Xa39; Rice bacterial blight; SSR; MAS

由黄单胞杆菌水稻致病变种(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)引起的白叶枯病是一种重要的水稻细菌病害, 该病害在我国南方稻区以及亚洲东南亚稻区经常暴发成灾, 是水稻高产、稳产的重要限制因子之一[1]。培育和种植抗病品种是防治水稻白叶枯病害最经济有效的方法。迄今, 国内外已鉴定了39个白叶枯病抗性基因[2, 3], 但是由于大多抗性基因的抗谱较窄、部分抗病基因仅具有成株期抗性, 以及来源于野生稻的抗病基因难以转育等问题, 在水稻育种中有较大利用价值的抗性基因资源十分有限。20世纪80年代以来, 国内外水稻抗病育种中主要利用的白叶枯病抗性基因包括Xa3Xa4Xa21Xa23[4]。大面积种植携带单一抗病基因水稻品种, 易于导致新毒力菌株出现而使品种抗性丧失。20世纪90年代以来, 我国广东以及东南亚其他稻区相继出现了对Xa4Xa21有毒力的菌株[5, 6, 7]。通过分子标记辅助选择抗病新基因或聚合已知抗病基因对于培育具有广谱持久抗性的水稻品种具有重要意义[8, 9]。近年来, 国内外研究者越来越重视通过多基因的聚合提高水稻的抗病性。如Luo等[10]通过聚合获得了抗白叶枯病基因Xa4Xa21Xa27多抗水稻恢复系, 闫成业等[11]利用分子标记辅助选择聚合Xa7、Xa21cry1C* 基因改良了杂交水稻金优207的白叶枯病和螟虫抗性。

Xa39是从我国籼稻常规稻黄华占为轮回亲本、以菲律宾籼稻品种PSBRC66 (P66)为供体亲本的回交导入系中鉴定的一个水稻白叶枯病显性抗性基因, 该基因对我国和菲律宾的白叶枯病菌代表病原型和生理小种均表现高度抗病[2], 在常规稻和杂交稻育种中具有广泛的应用前景。在前期研究中, 我们已将Xa39定位在水稻第11染色体上[2]。本研究利用4个育种F2分离群体, 评价了2个与Xa39紧密连锁的共显性分子标记和一个显性标记DM13, 以期筛选出适合对该基因进行分子标记辅助选择(MAS)的PCR分子标记。

1 材料与方法
1.1 群体构建

FF329是从黄华占为轮回亲本、P66为供体亲本在BC1F4群体中选出的携带Xa39的抗病株系。2013年在北京中国农业科学院作物科学研究所昌平试验地以FF329[2]为父本, 以4个杂交稻亲本品系BT4、BT6、BT12、BT18为母本, 配制F1杂交组合。2013年冬季, 将全部F1种植于中国农业科学院作物科学研究所海南试验地, 收取各F1单株苗期叶片, 提取DNA, 利用随机筛选的10对在亲本间有多态性的分子标记进行真杂种鉴定, 收取真杂种单株种子, 从而获得F2分离群体。

1.2 人工接种与抗性鉴定

采用Xoo菲律宾6号生理小种代表菌株PXO99[12]接种F1单株和F2分离群体。菌种保存于-80℃的甘油中, 接种前在PSA培养基上复壮, 挑取单菌落, 经毒力测试后保存于4℃。用PSA培养基于28℃培养菌株32~48 h, 配制成108 cfu mL-1菌液用于接种试验[13]

2014年正季, 将供试水稻亲本F1和F2材料种植于中国农业科学院作物科学研究所内的网室, 以导入系亲本黄华占和抗病亲本FF329为对照。在水稻植株的分蘖期采用剪叶法接种[14], 每个单株接种7~10张叶片。接种18 d后, 当供试亲本充分发病且病情发展稳定时, 调查接种各单株的病斑长度, 每株调查5张叶片, 计算各株病斑长度平均值, 病斑长度< 1 cm为高抗、1~5 cm为抗病、5~10 cm为中抗、10~15 cm为中感、> 15 cm为感病。

1.3 分子标记及PCR

人工接种前, 取各F2单株1~2张叶片, 采用CTAB法提取DNA[15]。选择Xa39两侧的紧密连锁的分子标记RM26985、DM13和RM206 (表1)用于F2群体MAS有效性分析。

表1 用于Xa39基因检测的特异性引物 Table 1 Specific primer pairs used for detecting the Xa39 gene

PCR扩增体系20 µ L, 包括10× 缓冲液2.0 µ L, 10× TB 1.5 µ L, 5 µ mol L-1引物2.0 µ L, Taq DNA聚合酶0.5 µ L, DNA 5 µ L, ddH2O 4 µ L。扩增程序为94℃预变性5 min, 94℃变性1 min, 55℃ (或61℃、67℃)退火45 s, 72℃延伸45 s, 从变性到延伸循环35次, 最后在72℃下保温10 min, 10℃保存。扩增产物经8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离1.5 h左右, 用已配好的genefinder染料染色, 在紫外灯下扫描照相, 读取标记基因型数据。

2 结果与分析
2.1 亲本及其F2分离群体对白叶枯病的抗性表现

4个杂交稻亲本BT4、BT6、BT12、BT18在分蘖盛期对白叶枯病病菌代表菌株PXO99表现中等抗病、中等感病和感病, 病斑长度为8.6~16.1 cm; 携带Xa39的抗病株系FF329对PXO99表现典型的过敏性坏死反应, 病斑长度小于0.5 cm (表2)。

表2 亲本对白叶枯病菌代表菌株PXO99的反应 Table 2 The resistance reaction of parents after inoculation withXanthomonas oryzae pv. oryzaePXO99

采用PXO99对FF329与上述4个杂交稻亲本的F2代分离群体进行白叶枯病抗性鉴定, 各群体单株均表现抗感分离(表3)。卡方检验结果表明, F2群体的抗感植株符合3∶ 1抗感分离(P> 0.7) (表3)。

表3 F2分离群体对白叶枯病菌PXO99的抗性表现 Table 3 Resistance reactions of F2 population to PXO99 population
2.2 Xa39基因的分子标记辅助选择效率

选择与Xa39紧密连锁的分子标记RM26985、RM206、DM13对4个F2分离群体的775个单株进行PCR扩增(图1)。其中RM26985、RM206是共显性分子标记, 能区分出纯合抗病基因型和杂合抗病基因型, 而DM13是显性分子标记, 不能区分纯合抗病基因型和杂合抗病基因型且在纯合感病植株(图1-B, 第1、第3、第6、第9株)上有一条杂带, 所以本研究主要对RM26985和RM206进行MAS效率评价。

图1Xa39紧密连锁的3个分子标记在分离群体中的PCR扩增结果.
A、B、C: 分子标记RM26985、DM13、RM206对4FL10/FF329 F2分离群体亲本(1: BT4; 2: FF329)及部分单株(3~16) PCR扩增产物在8%聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。M: 分子量。向左的箭头表示抗病单株带型。
Fig. 1 PCR amplification products of three molecular markers closely linked with Xa39.
A, B, C: PCR amplification products of RM26985, DM13, and RM206 in partial F2 individuals (3-16) of the 4FL10/FF329 population and their parents BT4 (1) and FF329 (2) on 8% polyacrylamide gel. M: DNA ladder. Arrows point to the left indicate the PCR products of BB resistant individuals.

利用位于Xa39基因两侧的紧密连锁分子标记RM26985和RM206对F2群体的各单株进行PCR检测, 评价这2个分子标记对Xa39基因MAS的效率。从表4可以看出利用RM26985分子标记检测4FL10群体的198个F2单株, 接种表型鉴定表明抗病的148个单株(抗病亚群)中有抗病带型的147个, 有感病带型的植株1个, 基因型与表型符合率为99.32%; 感病的50株(感病亚群)中, 分子标记检测到感病带型的植株为47个, 抗病带型的植株为3个, 符合率为94.00%, 整个4FL10群体MAS的符合率为96.66%。利用上述方法得到分子标记RM206对4FL10群体的

表4 4FL10、4FL14、4FL17、4FL21四个F2群体分子标记检测与田间抗感表型的符合率 Table 4 Marker-assisted selection efficiency in four F2 breeding populations

MAS符合率为92.66%; 对于4FL14群体, RM26985和RM206标记的MAS符合率均为95.72%, 其中RM206标记的MAS符合率有所提高; 对于4FL17群体, RM26985和RM206标记的MAS符合率分别为95.60%和93.55%, 而对于4FL21群体, RM26985和RM206标记的MAS符合率分别为95.27%和92.50%。可以看出, 标记RM26985对各个群体的MAS平均符合率95.81%, 高于RM206。抗病亚群中的MAS符合率均高于感病亚群的MAS符合率, 两者差值范围3.2%~13.3% (表4), 原因是部分单株在接种鉴定中抗感反应不够清晰, 对病斑长度介于抗病和感病之间的判断不够准确, 对本研究中亚群体规模较小的感病亚群影响较大, 导致感病亚群体的标记选择符合率较低。

在4FL10群体中, 利用RM26985和RM206两个分子标记同时检测4FL10群体的195个F2单株, 接种表型鉴定表明抗病的148个单株(抗病亚群)中有抗病带型的147个, 有感病带型的植株1个, 基因型与表型符合率为99.32%; 感病的47株(感病亚群)中, 分子标记检测到感病带型的植株为44个, 抗病带型的植株为3个, 符合率为93.61%, 整个4FL10群体MAS的符合率为95.50% (表5)。同时利用RM26985和RM 206标记的MAS符合率对于群体4FL14为95.72%, 对群体4FL17标记MAS符合率为95.48%, 而对于4FL21群体达到94.71% (表5)。平均来看, 同时利用标记RM26985和RM206对F2分离群体的MAS符合率为95.59%, 与使用单个标记RM26985的MAS准确率(表4)近似。在本研究所用群体中RM26985一侧发现的重组单株在利用2个分子标记预测表型结果时同样判断错误, 但是使用2个分子标记时有少数单株在其中一个标记基因型缺失, 导致符合率计算时总株数减少, 这使得使用2个分子标记的符合率略低于只利用一个RM26985标记的符合率, 当基因型无缺失的情况下, 两符合率应该相同, 这也表明使用单个分子标记RM26985就能达到分子标记辅助选择育种的要求。

表5 同时使用Xa39基因两侧的分子标记的MAS符合率 Table 5 MAS efficiency when using two markers flanking Xa39
3 讨论

通过聚合多个不同抗病基因[8], 一方面可以拓宽水稻品种的抗谱, 另一方面能够降低因大面积种植携带单一抗病基因水稻品种而造成的抗性迅速丧失的风险, 使水稻品种具有相对持久抗性。分子标记辅助选择技术的特点是准确、快速, 且不受环境影响, 是多基因聚合的有效手段。利用与抗病基因紧密连锁的分子标记跟踪目标基因, 因基因型不受环境条件和病原小种的限制和影响, 在水稻白叶枯病抗性基因的转育和聚合中得以广泛应用。但分子标记辅助选择的准确性很大程度上依赖于标记与目的基因的连锁紧密程度, 选择标记与目的基因连锁越紧密, 辅助选择结果越准确可靠[16]。对于Xa4Xa21Xa23等白叶枯病抗性基因, MAS在其育种利用中发挥了作用[17, 18, 19]。Zhou等[20]利用MAS培育了携带Xa23的杂交稻亲本, 并聚合了细菌性条斑病抗性基因[21]; Wang等[22]报道了与抗病基因Xa23共分离的分子标记; Yoshimura等[23]利用MAS育成Xa4xa5聚合系; Huang等[24]用RFLP和PCR标记对白叶枯病抗性基因累加系进行选择, 成功地构建了含Xa4xa5xa13Xa21的多基因累加系。

Xa39是一个完全显性的广谱白叶枯病抗性基因, 携带该基因的水稻植株对Xa4的毒力菌株CV[25]Xa21的毒力菌株GV[26]均表现免疫反应, 因此该基因在常规稻和杂交稻的白叶枯病抗性改良中具有重要的应用价值。鉴定与Xa39紧密连锁的分子标记, 通过MAS不仅可以加速该基因的转育进程, 而且可以实现该基因与其他抗病基因的聚合(如目前尚未发现Xa23Xa39的鉴别菌株)。郑乐康等[27]认为用于MAS的分子标记与目标基因的遗传距离小于5.0 cM有利于保证选择的准确性。因此在水稻抗病育种过程中, 可以利用该标记和与Xa4Xa21Xa23等白叶枯抗病基因紧密连锁标记共同进行MAS聚合育种, 获得Xa39与多个抗病基因的聚合系, 从而培育具有广谱持久抗性的水稻品种。

4 结论

本研究评价了3个与Xa39紧密连锁分子标记的选择效率, 显性分子标记DM13不能区分纯合抗病基因型和杂合抗病基因型, 具有局限性。RM26985和RM206位于Xa39基因的两侧, 与Xa39的遗传距离分别为0.36 cM和1.20 cM[2], 其分子标记辅助选择准确率分别为95.81%和93.61%, 同时使用位于Xa39基因两侧的分子标记RM26985和RM206的MAS准确率与单个使用标记RM26985的MAS准确率相当, 所以在只利用与Xa39基因紧密连锁的分子标记RM26985就可以用于Xa39的标记辅助选择。

The authors have declared that no competing interests exist.

作者已声明无竞争性利益关系。

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