甘蔗品种福农40 (FN40), 由本实验室提供。取FN40腋芽, 采用腋芽快繁的方法获得无毒组培苗^[11]。培养温度24℃, 湿度60%, 16 h光照(光照度为37.5 μ mol s^-1 m^-2)/8 h黑暗, 促根后移至穴盘中水培, 每天换水一次。待组培苗长到5片完全展开叶时, 选取长势一致的幼苗进行低温(4℃, 30 min、1、2、4和8 h)、高盐(250 mmol L^-1 NaCl, 3、6、12、24和48 h)、干旱(30% PEG-8000, 3、6、12和24 h)、ABA (100 μ mol L^-1 ABA, 6、12、24和48 h)胁迫处理, 每个处理3个重复, 每个重复3株, 并以正常生长条件下的甘蔗幼苗作为对照, 进行取样^{[12, 13, 14]}。另外, 将甘蔗品种FN40种植于本实验室的温室内, 正常水肥管理, 白天最高温度为30℃, 夜晚最低温度为22℃, 湿度为60%, 待其长到成熟期, 有20个节间时, 随机选择3株长势一致的植株, 采集出现可见肥厚带的+1叶, 用酒精棉擦拭、消毒, 取第7节间茎, 及白色嫩根, 用清水漂洗干净, 用液氮速冻所有样品, 置-80℃冰箱保存备用。

采用TRIzol试剂提取总RNA。使用Nanodrop (Thermo Scientific, USA)测定RNA的浓度, 按照Prime Script RT-PCR Kit使用说明书, 将mRNA反转录成cDNA第1链, 用于后续基因扩增和作为实时荧光定量PCR的模板。

以玉米CBF1基因序列(EU975322.1)为模板序列, 利用Primer Premier 5软件根据玉米CBF1基因5'、3'端保守区域设计特异性引物, 以盐胁迫3 h的甘蔗组培苗叶片的cDNA作为模板, 利用ScCBF1特异性引物(表1)进行PCR扩增。反应体系为25 µ L, 含Ex Taq 0.125 µ L, 10× PCR buffer 2.5 µ L, dNTPs 2 µ L, 正反向引物各1 µ L, 模板1 µ L, ddH₂O 17.375 µ L。反应条件为94℃ 4 min; 94℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 1 min, 35个循环; 72℃ 10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳, 回收目的片段, 将其连接到pMD 19-T Vector中, 然后转化大肠杆菌DH5α 感受态细胞, 经过蓝白斑筛选以及菌液PCR验证后, 委托生工生物工程(上海)有限公司测序。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 ScCBF1基因克隆与表达所用引物 Table 1 Primers used in ScCBF1 gene cloning and expression analysis 引物名称 Primer 上游引物序列 Forward primer sequence (5'→ 3') 下游引物序列 Reverse primer sequence (5'→ 3') 用途 Use ScCBF1 ATTCCAATCTGGTCTCGC CAAACCCACCAATCTACG 基因克隆 Gene cloning ScCBF1-Q CGGACGGTTCATTTCATTCTC GCTTCTTCTTGAACTCCTCCC 荧光定量 Real-time PCR GAPDH-Q CACGGCCACTGGAAGCA TCCTCAGGGTTCCTGATGCC 荧光定量 Real-time PCR ScCBF1-PE CGGAATTCATGGGGAAGAACCAGGCGTAC CCCTCGAGTTACTTCCCGAAGAATTTGG 原核表达Prokaryotic expression 下画线部分表示酶切位点。Sequences underlined indicate enzyme restriction site.

表1 ScCBF1基因克隆与表达所用引物 Table 1 Primers used in ScCBF1 gene cloning and expression analysis

利用DNAMAN和ORF Finder软件, 对克隆获得的ScCBF1基因的核酸序列及其推测氨基酸序列进行分析; 利用ExPASy服务器(http://www.expasy.org/proteomics)的ProtParam、Compute pI/Mw和ProtScale工具预测ScCBF1蛋白的理化性质和亲疏水性; 利用TEPRED (http://embnet.vital-it.ch/software/TMPRED_form.html)和TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)工具分析ScCBF1蛋白的跨膜结构域; 利用SignalP4.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/Services/SignalP/)预测ScCBF1蛋白的信号肽; 利用在线软件PSORT (http://psort.hge.jp/form.html)预测ScCBF1的亚细胞定位; 用SOPMA工具 (https://npsaprabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html), 对ScCBF1蛋白进行二级结构预测; 利用DNAMAN进行多序列比对; 利用ClustalX、MEGA5.1 (Neighbor-Joining)构建系统进化树。

根据测序获得的目的序列的ORF, 设计特异性引物(表1), 以CBF1质粒为模板, 扩增并回收目的基因片段。反应体系为25 µ L, 含Ex Taq 0.125 µ L, 10× PCR buffer 2.5 µ L, dNTPs 2 µ L, 上下引物各1 µ L, 模板1 µ L, ddH₂O 17.375 µ L。反应条件为94℃ 4 min; 94℃ 30 s, 66℃ 30 s, 72℃ 1 min, 35个循环; 72℃ 10 min。利用1%琼脂糖凝胶电泳检测并回收纯化CBF1的目的片段, 利用T4连接酶, 16℃连接过夜, 连接到同样双酶切表达载体pGEX-6P-1, 转化大肠杆菌DH5α 感受态细胞, 经过蓝白斑筛选以及利用EcoR I 和 Xho I内切酶双酶切鉴定和质粒PCR鉴定, 命名为pGEX-6P-1-ScCBF1, 委托上海生物工程技术有限公司测序。

将空质粒和重组质粒转化入宿主菌E. coli Rosetta (DE3)中, 挑取单菌落。接种至含有50 mg L^-1氨苄青霉素的LB液体培养基中, 37℃培养过夜。取1 mL培养物接种至10 mL LB液体培养基(含50 mg L^-1 Amp)中培养至OD₆₀₀为0.6时, 加入终浓度为1 mmol L^-1的IPTG, 37℃诱导至12 h (每2 h取样1 mL), 分别收集菌液, 4℃, 8000 × g, 离心10 min后收集菌体, 加入25 µ L蛋白加样缓冲液, 沸水浴5 min, 常温下12 000 × g, 5 min, 吸取10 µ L上清液, 12% SDS-PAGE电泳检测融合蛋白的表达。

根据克隆获得到的ScCBF1基因的ORF序列, 设计特异性实时荧光定量PCR引物, 以GAPDH基因(表1)作为内参基因^{[15, 16]}。按照SYBR Green说明书叙述的定量反应体系, 在7500型实时荧光定量PCR仪(ABI, USA)上完成定量PCR扩增。每个样品设置3次技术重复。扩增程序为50℃ 2 min; 40个循环PCR扩增(95℃ 10 min; 95℃ 15 s, 60℃ 1 min)。反应结束后, 采用2^{-Δ Δ Ct}算法分析获得的数据^[17]。

利用RT-PCR克隆技术克隆得到一个甘蔗ScCBF1基因(图1)。序列分析显示, 该基因cDNA全长708 bp, 其ORF长度为603 bp (41~643 bp), 共编码200个氨基酸(图2)。利用NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的BlastN工具比对得知, ScCBF1基因与高粱(Sorghum bicolor)、玉米(Zea mays)、水稻(Oryza sativa)、二穗短柄草(Brachypodium distachyon)等物种CBF基因高度同源, 相似性分别为96%、94%、78%和75%。

图1

Fig. 1

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	图1 甘蔗ScCBF1基因的PCR扩增结果. M: 100 bp分子量标记; 1: PCR扩增产物。Fig. 1 PCR amplified products of ScCBF1. M: 100 bp ladder marker; 1: PCR amplified product.

图2

Fig. 2

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	图2 甘蔗ScCBF1基因的cDNA序列及其推导的氨基酸序列(* 终止密码子). 下画线表示翻译起始位点。Fig. 2 The nucleotide acid sequence of ScCBF1 and its deduced amino acid sequence (* stop codon). Underline indicates translation initiation site.

ProtParam、Compute PI/MW分析表明, ScCBF1的理论分子量为22.80 kD, 理论等电点为10.31, 不稳定系数预测为75.41, 表明其为不稳定蛋白。总平均疏水性是-1.699, 表明该蛋白可能是一种可溶性蛋白。利用ProtScale在线软件对ScCBF1氨基酸序列进行分析表明, 该蛋白N端有明显的亲水性, 是亲水蛋白。且整条多肽链没有明显的疏水区, 多表现为亲水性, 推断甘蔗ScCBF1是一种可溶性蛋白。利用TMpred和TMHMM在线分析, 均未发现明显跨膜结构域, 表明ScCBF1不是跨膜蛋白。利用SignalP4.1 Server对ScCBF1蛋白的信号肽预测表明, ScCBF1蛋白的N端不含信号肽, 是非分泌蛋白。利用PSORT在线软件分析得知ScCBF1定位于细胞质。利用在线软件SOPMA, 对ScCBF1蛋白的二级结构预测分析表明, ScCBF1蛋白主要存在4种次级结构, 所占比例从高到低依次是无规则卷曲56.55%、α 螺旋33.33%、延伸链5.99%、β 折叠4.12%。

以ScCBF1的氨基酸序列为查询探针, 利用NCBI中的BlastP程序来比对GenBank的非冗余蛋白序列数据库。在高粱、玉米、水稻、二穗短柄草(Brachypodium distachyon)等植物中比对出多个CBF蛋白, 表明CBF蛋白可普遍存在于植物中。将甘蔗与高粱(Sorghum bicolor, XP_002448114.1)、玉米(Zea mays, ACG47440.1)、水稻(Oryza sativa, EAY94703.1)、二穗短柄草(Brachypodium distachyon, XP_003580 064.1)的蛋白序列进行多序列比对, 结果表明, 甘蔗ScCBF1蛋白与其他物种CBF蛋白在N端有较大的保守性, C端保守性较差(图3)。甘蔗ScCBF1蛋白与高粱、玉米、水稻和二穗短柄草的蛋白相似度分别为96%、94%、78%和75%, 表明ScCBF1基因编码氨基酸序列与单子叶植物的同源性较高。

图3

Fig. 3

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	图3 甘蔗ScCBF1氨基酸序列与其他植物同源性比对Fig. 3 Homologous comparison of ScCBF1 amino acid sequences among sugarcane and other plant species

以小立碗藓(Physcomitrella patens, XP_ 001772035.1)的CBF蛋白序列用作外源序列, 使用MEGA 5.1, 采用NJ法(BootStrap 1000)构建进化树, 分析ScCBF1蛋白与其他物种CBF蛋白的进化关系(图4)。结果表明, ScCBF1与高粱、玉米等物种进化距离较近, 而与葡萄、蓖麻等物种进化距离较远。进化树可以划分为2个群。群I包括甘蔗、高粱、玉米、水稻、二穗短柄草、乌拉尔图小麦(Triticum urartu, EMS57768.1)等单子叶植物; 群II包括拟南芥(Arabidopsis thaliana, BAD44323.1)、大豆(Glycine max, NP_001242360.1)、葡萄(Vitis vinifera, XP_ 002278183.2)、蓖麻(Ricinus communis, XP_002524849.1)和杨树(Populus trichocarpa, XP_002319689.1)等双子叶植物。在群I中, C₃和C₄植物的CBF1形成2个分支。分析表明, CBF1在遗传进化上具有明显的种属差异。

图4

Fig. 4

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	图4 不同物种转录激活因子CBF1的系统进化分析Fig. 4 Phylogenetic analysis of CBF1s from different plant species

根据荧光定量的数据分析ScCBF1基因的相对表达量(采用2^{-Δ Δ Ct}算法分析实验数据), 甘蔗幼苗叶片在不同胁迫处理下的定量结果显示(图5), ScCBF1基因能够被低温(4℃)、干旱(30% PEG-8000)、ABA (100 μ mol L^-1 ABA)强烈诱导上调表达, 而在NaCl (250 mmol L^-1 NaCl)胁迫下, 基因的表达量显著下调表达, 说明NaCl抑制ScCBF1的表达(图5-B)。ScCBF1明显受4℃低温强烈诱导表达, 胁迫处理30 min后即强烈上调表达, 于2 h达到最大值, 基因表达量是0 h的6倍, 随后降低(图5-A)。PEG胁迫处理6 h后, ScCBF1表达量达到最大值, 随着胁迫时间增加, 表达量逐渐降低, 胁迫处理48 h后, 基因表达量最低(图5-C)。ABA胁迫处理6 h后基因表达量最大, 6 h表达量约是0 h的3倍, 表明ScCBF1受ABA诱导表达, 进而说明该基因在逆境胁迫应答过程中, 可能是通过依赖ABA途径来进行(图5-D)。ScCBF1基因的组织差异特异性表达结果表明, ScCBF1在根中表达量最高, 其次是在茎中表达, 在叶中的表达量最小(图6)。

图5

Fig. 5

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	图5 ScCBF1基因在不同胁迫下的表达Fig. 5 qRT-PCR analysis of ScCBF1 expression in different stress treatments

图6

Fig. 6

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	图6 ScCBF1基因在根、茎、叶中的表达情况Fig. 6 Expression analysis of ScCBF1 from organs in sugarcane

将重组质粒pGEX-6P-1-ScCBF1转化至大肠杆菌DH5α 感受态细胞, 经过蓝白斑筛选, 对构建的重组质粒用EcoR I、Xho I内切酶进行双酶切鉴定和质粒PCR验证, 酶切产物呈现清晰的两条泳带, 分别在600 bp (目的基因片段)和5000 bp (载体片段)左右; 质粒PCR结果显示只有一条单一的目的基因条带(600 bp左右)。对重组质粒测序显示, 序列与原克隆序列一致, 表明原核表达载体构建成功(图7), 命名为pGEX-6P-1-ScCBF1。重组质粒SDS-PAGE电泳结果显示, 在分子量50 kD左右处可见一条特异性条带, CBF1蛋白的大小理论约为22 kD, 加上pGEX- 6P-1载体上的GST标签蛋白大小约为26 kD, 因此与本文预测的蛋白大小基本相符, 可以确定该融合蛋白成功表达(图8)。为进一步开展ScCBF1基因的遗传转化工作奠定了有益基础。

图7

Fig. 7

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	图7 pGEX-6P-1-ScCBF1重组质粒双酶切PCR鉴定. M1: 15000+2000 bp 分子量标记; M2: 100 bp marker; 1~2: 重组质粒双酶切片段; 3~4: 质粒PCR目的片段。Fig. 7 PCR identification of pGEX-6P-1-ScCBF1 with EcoR I/Xho I. M1: 15000+2000 bp marker; M2: 100 bp marker; 1-2: enzyme digestion fractions of pGEX-6P-1-ScCBF1; 3-4: amplification product from the plasmid.

图8

Fig. 8

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	图8 诱导表达产物的SDS-PAGE分析. M: 蛋白质分子质量标准; 1: 未诱导空质粒; 2: IPTG诱导12 h后的空质粒; 3: 未诱导重组质粒; 4~9: IPTG分别诱导2、4、6、8、10和12 h后的重组质粒。Fig. 8 Analysis of expressed proteins by SDS-PAGE. M: protein molecular weight marker; 1: pGEX-6P-1 without induction; 2: pGEX-6P-1 after inducing for 12 h; 3: pGEX-6P-1-ScCBF1 without induction; 4-9: pGEX-6P-1-ScCBF1 after inducing for 2, 4, 6, 8, 10, and 12 hours, respectively.