试验于2013年4月至7月在中国农业科学院作物科学研究所北京昌平试验站温室中进行, 气温(25± 5)℃, 相对湿度70%± 15%, 自然光昼夜循环。参考普通菜豆芽期抗旱性鉴定结果^[12], 选取50份不同抗旱性品种为试材, 所有种子由中国农业科学院作物科学研究所提供, 来源于我国普通菜豆主产区黑龙江、山西、云南等地(表1)。

选取不同品种饱满的种子各100粒整齐放入发芽盒(长12 cm, 宽12 cm, 高6 cm), 置25℃恒温培养箱中萌发, 2 d后选取健壮幼芽转移至塑料花盆中(盆高40 cm, 内径35 cm), 每盆16粒, 盆土由珍珠岩、蛭石和育苗土按质量比4∶ 3∶ 3混合而成, 并提前用敌百虫和多菌灵杀菌灭虫, 每盆装土9.5 kg, 播前各盆浇底水至田间持水量的80% (16.5%绝对含水量), 播种后覆土1.0 kg。

采用随机区组设计, 设置正常供水(对照)和反复干旱2种处理, 3次重复。幼苗长至第一个三出复叶展开时去除病株, 调查每盆苗数后进行第1次干旱处理。以称重法监测, 当土壤绝对含水量降至田间持水量的30% (5.6%绝对含水量)时, 复水至田间持水量的80%。第1次复水后停止供水, 此时幼苗主茎伸展3~4节, 随即进行第2次干旱处理, 当土壤绝对含水量降至田间持水量的20% (3.8%绝对含水量)时再次复水。

参考大豆抗旱育种中提出的冠层萎蔫指数标准^[13], 普通菜豆的萎蔫指数, 0级为无萎蔫; 1级为微萎蔫(萎蔫出现在个别植株); 2级为萎蔫(一半的植株或较多的植株萎蔫); 3级为明显萎蔫(多数植株萎蔫); 4级为严重萎蔫(叶片灼烧或大部分植株叶片卷曲); 5级为完全萎蔫(叶片黄化、褐化或大部分叶片死亡和脱落)。

第一次复水前3 d, 每盆随机选取3株测定各项生理指标。采用便携式叶绿素荧光测定仪(MINI-PAM)测定PSII最大量子产量(F_v/F_m)^[14]; 便携式叶绿素测定仪(SPAD-502)测定叶绿素含量^[15]; 稳态气孔计(SC-1)测定气孔导度^[16]; 便携式叶面积测定仪(Li-3000)测定叶面积^[17]; 称重法测定叶片相对含水量(RWC)^[3]; 每次复水2 d后记录幼苗存活数, 以叶片鲜绿色为存活; 第2次存活数调查结束后洗根, 并于110℃杀青30 min, 80℃烘24 h后测定茎叶干重和根干重, 生物量为两者之和。

参照文献所述^{[18, 19, 20, 21]}, 计算反复干旱存活率、抗旱系数、抗旱指数及隶属函数, 利用公式(5)进行数据标准化处理后计算关联系数和关联度, 最终按照公式(8)、(9)计算加权抗旱指数和抗旱度量值D。

反复干旱存活率 (1)

抗旱系数 (2)

抗旱指数 (3)

隶属函数 (4)

数据标准化 (5)

关联系数

(6)

关联度 (7)

加权抗旱指数 (8)

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 供试材料名称、来源、加权抗旱指数及D值 Table 1 Name, origin, WDI, and D-value of tested germplasm resources 材料 Material 来源 Origin 加权抗旱指数 WDI 排序 Rank D值 D-value 排序 Rank 白金德利豆 Baijindelidou 黑龙江 Heilongjiang 2.482 1 0.672 1 260205 云南 Yunnan 1.943 2 0.538 4 跃进豆 Yuejindou 内蒙古 Inner Mongolia 1.813 3 0.612 2 圆白菜豆 Yuanbaicaidou 内蒙古 Inner Mongolia 1.641 4 0.501 5 兔子腿 Tuzitui 黑龙江 Heilongjiang 1.173 5 0.546 3 红芸豆3号 Hongyundou 3 河北 Hebei 0.994 6 0.477 6 饭豆 Fandou 黑龙江 Heilongjiang 0.805 7 0.440 7 60天还家 60 Tianhuanjia 黑龙江 Heilongjiang 0.685 8 0.391 8 白菜豆 Baicaidou 内蒙古 Inner Mongolia 0.685 9 0.352 9 四季豆 Sijidou 云南 Yunnan 0.625 10 0.291 22 白饭豆 Baifandou 黑龙江 Heilongjiang 0.604 11 0.301 19 菜豆 Caidou 内蒙古 Inner Mongolia 0.602 12 0.304 18 八月炸豆子 Bayuezhadouzi 陕西 Shaanxi 0.599 13 0.309 17 奶花芸豆 Naihuayundou 四川 Sichuan 0.581 14 0.342 11 橙黄金豆 Chenghuangjindou 陕西 Shaanxi 0.568 15 0.342 10 白菜豆 Baicaidou 内蒙古 Inner Mongolia 0.557 16 0.341 12 FOT25 国际热带农业研究中心CIAT 0.541 17 0.256 28 白毛豆 Baimaodou 黑龙江 Heilongjiang 0.535 18 0.318 16 黑金豆 Heijindou 山西 Shanxi 0.496 19 0.296 20 白菜豆 Baicaidou 山西 Shanxi 0.492 20 0.327 14 挑花枚白连豆 Tiaohuameibailiandou 内蒙古 Inner Mongolia 0.487 21 0.261 27 品芸1号 Pinyun 1 黑龙江 Heilongjiang 0.487 22 0.226 39 龙22-0579 Long 22-0579 黑龙江 Heilongjiang 0.483 23 0.328 13 干枝密 Ganzhimi 黑龙江 Heilongjiang 0.451 24 0.319 15 白菜豆 Baicaidou 内蒙古 Inner Mongolia 0.447 25 0.238 34 饭豆 Fandou 黑龙江 Heilongjiang 0.438 26 0.250 30 黑色红豆 Heisehongdou 山西 Shanxi 0.436 27 0.295 21 黑芸豆 Heiyundou 陕西 Shaanxi 0.431 28 0.232 37 黑红豆 Heihongdou 陕西 Shaanxi 0.406 29 0.218 42 NV 云南 Yunnan 0.400 30 0.262 26 家雀蛋 Jiaquedan 黑龙江 Heilongjiang 0.392 31 0.272 24 菜豆 Caidou 内蒙古 Inner Mongolia 0.391 32 0.278 23 黑芸豆 Heiyundou 不详 Unknown 0.389 33 0.238 33 长饭豆 Changfandou 黑龙江 Heilongjiang 0.388 34 0.265 25 小白豆 Xiaobaidou 内蒙古 Inner Mongolia 0.378 35 0.208 43 菜豆 Caidou 内蒙古 Inner Mongolia 0.364 36 0.254 29 白连豆 Bailiandou 内蒙古 Inner Mongolia 0.359 37 0.245 31 白饭豆 Baifandou 黑龙江 Heilongjiang 0.359 38 0.244 32 花饭豆 Huafandou 黑龙江 Heilongjiang 0.359 39 0.237 35 奶花芸豆 Naihuayundou 不详 Unknown 0.348 40 0.186 47 小京豆 Xiaojingdou 云南 Yunnan 0.338 41 0.199 45 260219 云南 Yunnan 0.324 42 0.221 41 NR 云南 Yunnan 0.322 43 0.233 36 四季豆 Sijidou 云南 Yunnan 0.313 44 0.207 44 京豆 Jingdou 云南 Yunnan 0.307 45 0.231 38 腰子豆 Yaozidou 云南 Yunnan 0.303 46 0.224 40 FOI10 国际热带农业研究中心CIAT 0.275 47 0.183 48 大白豆 Dabaidou 吉林 Jilin 0.265 48 0.173 50 四季豆 Sijidou 云南 Yunnan 0.251 49 0.175 49 绿饭豆 Lü fandou 吉林 Jilin 0.192 50 0.189 46 CIAT: International Centre for Tropical Agriculture.

表1 供试材料名称、来源、加权抗旱指数及D值 Table 1 Name, origin, WDI, and D-value of tested germplasm resources

抗旱度量值 (9)

式中X_TT为处理组各品种幼苗基数的平均值, X_DS1和X_DS2分别为第1次和第2次复水后, 处理组各品种存活茎数的平均值。X_i(k)和CX_i(k)分别为处理组和对照组各品种各指标的测定值, 、 和S_i分别为数据无量纲处理后的结果及各指标在干旱胁迫下的平均值和标准差。PI_imax和PI_imin分别为某指标抗旱系数的最大值和最小值。 为参考序列值, 本文指各材料的综合抗旱指数(抗旱指数的平均值)。ρ 为分辨系数, 取值为0.5^[22], r_i为各性状与综合抗旱指数的关联度, 临界值为0.7^[23]。用Microsoft Excel 2007软件整理数据, 用DPS 13.5软件进行灰色关联度分析和模糊聚类分析。

不同材料的萎蔫情况差异较大, 一些材料对干旱胁迫表现高敏感, 如FOI10在第1次干旱处理后的萎蔫指数为4级, 2次干旱处理后大多植株干枯死亡; 另有一些材料表现出优良的保水能力或恢复能力, 如跃进豆在整个反复干旱试验中, 萎蔫指数始终为0级或1级, 白金德利豆在第1次干旱处理后的萎蔫指数为3级, 但复水后恢复为0级。计算2次干旱处理后的萎蔫指数平均值, 结果保留整数, 共得到0级品种2份, 分别为跃进豆和260205; 各级材料数见图1。

图1

Fig. 1

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	图1 不同萎蔫指数品种数目Fig. 1 Number of common bean varieties of each wilting index

此外, 计算各性状的抗旱系数, 参照次数分布统计方法以0.1为组距, 将其制作成次数分布表(表2)。结果表明, 供试材料中74%的叶片相对含水量抗旱系数0.8≤ PI< 1.0, 88%的气孔导度PI< 0.3, 而叶面积、叶绿素含量及PSII最大量子产量等性状的抗旱系数PI主要分布在0.3~0.8区间内。这说明叶片相对含水量对干旱胁迫的反应迟钝, 气孔导度对干旱反应敏感, 叶面积、叶绿素含量及PSII最大量子产量等性状属中间类型。由此可见, 普通菜豆的抗旱性和其他作物一样, 不同性状对干旱胁迫的敏感程度各异, 甚至有较大差距。所以, 用任何单一指标的抗旱系数进行评价缺乏稳定性和客观性, 必须用多个指标综合评价才较为可靠。

依照灰色关联度理论, 将50份材料的综合抗旱指数和干旱胁迫下的11个指标视作一个整体。以综合抗旱指数作为母序列, 各指标原始数据标准化值作为子数列建立灰色关联系统, 计算各指标与其综合抗旱指数的关联度。由表3可以看出, 在干旱环境下, 11个测定指标与综合抗旱指数的关联度从大到小的顺序为叶片相对含水量、PSII最大量子产量、叶绿素含量、反复干旱存活率、生物量、茎叶干重、根干重、气孔导度、根冠比、株高、叶面积, 其中前10种指标的关联度均大于0.7, 可以作为综合评价指标加以利用。

根据各指标与综合抗旱指数之间关联程度, 可将上述指标分为3类, 第1类是与叶片光合性能有关的指标, 包括叶片相对含水量、PSII最大量子产量和叶绿素含量, 它们与综合抗旱指数的关系最为紧密; 第2类主要是反映植株活力和干物质积累的性状, 包括反复干旱存活率、生物量和茎叶干重等, 与综合抗旱指数的关系较为紧密; 第3类包括根冠比、株高和叶面积等, 主要反映干旱胁迫下植株的形态特征。

选取关联度大于0.7的10个指标, 对各指标与综合抗旱指数的关联度作归一化处理, 计算出各指标的权重(表3)。将该权重分别与各材料各指标的综合抗旱指数和隶属函数值(公式4)相乘, 按材料对相乘结果求和, 最终得到各材料的加权抗旱指数(公式8)和抗旱度量值D (公式9)。根据加权抗旱指数和抗旱度量值D的大小对50份材料进行抗旱性排序(表1)。结果表明, 两种方法对不同材料的抗旱性排序虽有一定差异, 但变动范围较小。例如, 加权抗旱指数大于1.0的材料5份, 依次为白金德利豆、260205、跃进豆、圆白菜豆和兔子腿, 其抗旱度量值D均大于0.5, 分别排名第1、第4、第2、第5、第3位, 表现出稳定的抗旱性; 加权抗旱指数小于0.3的材料4份, 依次为FOI10、大白豆、四季豆和绿饭豆, 其D值均小于0.2, 分别排名第48、第50、第49、第46位, 对干旱胁迫敏感。

根据抗旱度量值D对不同材料聚类, 划分抗旱级别(图3)。当两者之间距离为0.12时, 可将50份普通菜豆品种聚为4类(A、B、C、D), 分别为高抗、中抗、敏感和高敏感。高抗材料为白金德利豆、跃进豆、兔子腿、圆白菜豆和260205, 占总数的10%, 主要来自于黑龙江和内蒙古; 中抗材料为60天还家、饭豆和红芸豆3号, 占总数的6%, 来源于黑龙江、河北; 敏感材料包括白菜豆、橙黄金豆和奶花芸豆等29份材料, 占总数的58%, 在各省份均有分布; 其余13份材料表现为高敏感, 占总数的26%, 主要来源于陕西和云南。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 普通菜豆各指标与综合抗旱指数关联度及关联序 Table 3 Correlation degree and correlation order between different parameters and comprehensive drought-resistance index of common bean 指标 Index 关联度 Correlation degree 权重 Weight 关联序 Correlative order 叶片相对含水量 Leaf relative water content 0.7726 0.0963 1 PSII最大光化学效率 Fv/Fm 0.7607 0.0949 2 叶绿素含量 Chlorophyll content 0.7435 0.0927 3 反复干旱存活率 Survival rate after repeated drought 0.7341 0.0915 4 生物量 Biomass 0.7329 0.0914 5 茎叶干重 Shoot dry weight 0.7314 0.0912 6 根干重 Root dry weight 0.7192 0.0897 7 气孔导度 Stomatal conductance 0.7159 0.0893 8 根冠比 Root/shoot ratio 0.7092 0.0884 9 株高 Plant height 0.7086 0.0884 10 叶面积 Leaf area 0.6910 0.0862 11

表3 普通菜豆各指标与综合抗旱指数关联度及关联序 Table 3 Correlation degree and correlation order between different parameters and comprehensive drought-resistance index of common bean

图3

Fig. 3

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	图3 不同普通菜豆品种抗旱度量值D的WPGMA法聚类结果A: 高抗; B: 中抗; C: 敏感; D: 高敏感。Fig. 3 WPGMA Clustering analysis of common bean varieties based on D-valueA: high resistance; B: moderate resistance; C: susceptible; D: highly susceptible.

指标的合理选择是普通菜豆抗旱性鉴定的关键, 对此国外学者进行了大量研究, 并发现多种性状与抗旱性相关。例如, Muñ oz-Perea等^[24]测定了干旱环境下6个普通菜豆品种的多项生理指标发现, 水分利用效率在不同抗旱性品种之间存在极显著差异; Mohamed等^[25]测定抗旱品种NE19和高敏感品种NE5在干旱环境下的叶片相对含水量表明, 该指标可以评价普通菜豆的保水能力; Wentworth等^[26]通过比较干旱环境下抗旱品种Orfeo和高敏感品种Arroz的光合特性, 认为叶绿素荧光参数的变化能够反映普通菜豆的抗旱性。然而, 以上研究存在一定的局限性, 一方面是试验材料不充分, 少数几份材料间的对比缺乏说服力, 事实证明, 目前所得大量指标在实际应用中的表现不尽人意, 鉴定效率较低^[27]; 另一方面, 由于以往研究多针对形态或生理等单一性状, 未能综合起来, 因而所鉴定的抗旱材料缺乏代表性, 制约了后续研究工作的全面开展。基于此, 本研究选取50份不同来源的普通菜豆品种, 涵盖不同的生态类型及生长习性, 同时结合了生物量、叶片相对含水量及PSII最大光化学效率等11项形态和生理指标, 通过灰色关联度理论综合分析增加了指标选取的准确性和全面性。结果显示, 普通菜豆苗期的抗旱性主要反映在叶片光合性能、植株活力以及形态特征3个方面, 其中光合性能的稳定性尤为重要; 此外, 本研究根据各性状与综合抗旱指数的关联度大小筛选出10项抗旱评价指标, 其中叶片相对含水量、PSII最大量子产量及叶绿素含量与抗旱性关系最为密切。因此, 普通菜豆苗期抗旱性鉴定中应注重叶片生理指标的选用, 以便对不同抗旱性材料进行准确区分。

根据指标的多寡可将抗旱性分析方法分为单指标分析和综合分析两大类^[8]。单指标分析一般选取与抗旱性相关度极高的指标, 如幼苗的干旱存活率^[28]或萎蔫指数^[29]等。然而这类指标往往只能反映植物个体对干旱胁迫的整体响应, 无法反映旱胁迫下不同性状的变化, 因此只适用于大量种质的初级筛选。正因如此, 目前小麦^[9]、谷子^[8]、油菜^[10]等大多数作物的抗旱性评价多采用综合分析方法。综合分析方法有多种类型, 例如, 高吉寅等^[30]将不同抗旱性指标分级, 再将各指标的级别值累加得到总级别值, 进而评价不同品种抗旱性。李壮等^[31]利用模糊数学中的隶属函数法计算不同品种的抗旱隶属值, 根据各指标的平均隶属值判定抗旱性的强弱。现阶段, 抗旱度量值D和加权抗旱指数是作物抗旱性鉴定中最常用的两种综合评价方法, 鉴定结果较为理想。例如, 谢小玉等^[10]采用抗旱度量值D对油菜苗期抗旱性综合评估并筛选获得优异品种, 通过研究性状随时间的变化规律, 充分肯定了鉴定结果的真实性; 王士强等^[23]利用加权抗旱指数比较65个小麦品种抗旱性的评价结果在一定程度上反映了品种的区域特征和适应性。因此, 本研究将加权抗旱指数和抗旱度量值D两种综合分析方法引入普通菜豆抗旱性评价, 改变了该作物传统的单指标分析思路, 可以为今后的评价工作提供借鉴。另外, 分析发现2种方法可以相互验证, 使鉴定结果更加可靠, 此观点在油菜和胡麻的抗旱性研究中也有所提及^{[10, 32]}。

通过对50份普通菜豆品种抗旱性分级, 筛选到高抗材料5份和中抗材料3份, 依次为白金德利豆、跃进豆、兔子腿、260205、圆白菜豆、红芸豆3号、饭豆和60天还家。获得抗性材料占供试材料的16%, 主要分布于黑龙江和内蒙古等寒冷或贫瘠区。因此, 在深入分析不同种质来源的基础上开展抗旱性鉴定有望提高资源筛选的效率, 进而加快育种进程, 由于本研究所选材料有限, 此观点是否正确仍需进一步研究。