ygl9来源于经化学诱变剂EMS处理的恢复系缙恢10号, 经过多代自交观察, 其黄绿叶表型遗传稳定。2013年, 将叶色表型正常不育系西农1A与ygl9杂交, 收获F₁种子。同年, 于海南种植F₁并收获F₂种子。2014年, 在西南大学水稻研究所研究基地种植亲本、F₂群体, 从苗期开始观察叶色表型。在同一块实验田相邻种植野生型缙恢10号和突变体ygl9各40株, 成熟后分别调查小区中间10株的株高、穗长、有效穗数、每穗粒数、每穗实粒数、结实率、千粒重等农艺性状。

苗期、分蘖期和抽穗期, 分别随机选取5株长势一致的野生型和突变体单株, 参照Lichtenthaler^[17]描述的方法测定叶片的光合色素含量。即将新鲜叶片中部去除中脉后, 称取0.1 g, 剪碎浸泡在丙酮∶ 无水乙醇(1∶ 1, v/v)混合液中, 定容至25 mL, 密封黑暗处理24~48 h, 期间轻轻震荡数次, 使光合色素浸提充分。用Beckman22S型分光光度计测量提取液在663 nm、645 nm、470 nm 3个波长下的吸光值, 重复3次, 计算光合色素的含量。

水稻孕穗期, 在晴天上午9:00— 11:00, 选择长势一致的野生型和突变体单株各5株, 利用LI-6400型便携式光合作用测定仪测定净光合速率、气孔导度、胞间CO₂浓度和蒸腾速率等光合特性, 每个单株重复测定3次, 取平均值。采用冷冻法观察野生型和突变体气孔特征, 以SU3500型扫描电镜观察并照相。

参照何瑞峰等^[18]的方法, 于抽穗期取野生型缙恢10号和突变体ygl9倒二叶中部叶片, 以戊二醛和锇酸双重固定后, 利用不同梯度的乙醇逐级脱水, 再置换和包埋, 制超薄切片, 以醋酸双氧铀和柠檬酸铅液双重染色, H600型透射电镜观察并照相, 分析叶肉细胞和叶绿体结构。

采用BSA^[19]法定位目标基因, 即从F₂分离群体中选取10株正常单株和10株突变单株, 剪取等量叶片构成正常基因池和突变基因池。采用改良的CTAB法提取亲本和基因池DNA^[20], 按碱煮法提取F₂群体DNA^[21]。参照http://www.gramene.org/microsat/公布的SSR引物, 并运用Vector NTI Advance 10自行设计InDel引物。SSR和InDel引物由上海英骏技术公司合成。PCR总体系为12.6 μ L, 含1.25 μ L 10× PCR buffer、1 μ L 50 ng μ L^-1 DNA模板、0.75 μ L 25 mmol L^-1 MgCl₂、0.5 μ L 2.5 mmol L^-1 dNTPs、8.0 μ L ddH₂O、1.0 μ L 10 μ mol L^-1引物、0.1 μ L 5 U μ L^-1TaqDNA聚合酶。PCR程序为94℃预变性5 min; 94℃变性30 s, 55℃退火30 s, 72℃复性1 min, 35个循环; 72℃延伸10 min。PCR产物经10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳, 快速银染后观察^[22]。

F₂定位群体中, 将具有西农1A带型的单株记为A, 具有ygl9突变亲本带型的单株记为B, 具有杂合带型的单株记为H, 用Mapmaker 3.0软件进行连锁分析和遗传作图^[23], 用Kosambi函数将重组率转化为遗传距离^[24]。

突变体ygl9叶片苗期呈现黄绿色(图1-A, B), 一直保持到拔节期(图1-C~E), 抽穗期叶色渐变为淡绿色(图1-F), 直至成熟; 野生型缙恢10号(WT)的叶片全生育期均呈绿色(图1)。与野生型相比, ygl9的株高、穗长、每穗粒数、每穗实粒数、结实率和千粒重等主要农艺性状均极显著降低, 分别降低了23.48%、11.34%、38.75%、53.95%、24.81%和30.46%, 仅有效穗数没有明显差异(表1)。

图1

Fig. 1

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	图1 野生型(WT)和ygl9突变体的表型特征Fig. 1 Plant morphology of the wild type (WT) and the ygl9 mutant

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 野生型(WT)与ygl9突变体主要农艺性状分析 Table 1 Main agronomic traits of the wild type (WT) and the ygl9 mutant 材料 Material 株高 Plant height (cm) 穗长 Panicle length (cm) 有效穗数Effective panicle 每穗粒数 Grain number per panicle 每穗实粒数 Filled grain number per panicle 结实率 Seed setting rate (%) 千粒重 1000-grain weight (g) WT 116.90± 4.85 24.61± 0.73 10.76± 1.53 177.98± 15.01 142.81± 11.27 80.24± 4.22 25.08± 0.29 ygl9 89.45± 3.49* * 21.82± 0.47* * 9.00± 1.80 109.01± 13.60* * 65.76± 14.09* * 60.33± 7.73* * 17.44± 0.08* * * * 表示在0.01水平上差异显著; 测量样本株数n=10。* * Significantly different at P< 0.01 by t-test; the sample number was 10.

表1 野生型(WT)与ygl9突变体主要农艺性状分析 Table 1 Main agronomic traits of the wild type (WT) and the ygl9 mutant

苗期与野生型相比, ygl9突变体的叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素和类胡萝卜素含量均极显著降低, 分别只有野生型的63.28%、47.90%、60.80%和66.95% (图2-A); 分蘖期, ygl9突变体的各光合色素含量仍然极显著低于野生型, 分别下降了33.72%、55.82%、36.91%和33.63% (图2-B); 抽穗后突变体叶色由黄绿色渐变为淡绿色, 与野生型相比, ygl9突变体的光合色素含量仅表现为显著降低(图2-C), 降低幅度明显小于苗期和分蘖期。

图2

Fig. 2

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	图2 野生型(WT)和ygl9突变体光合色素含量比较Fig. 2 Comparison of photosynthetic pigments contents between the wild type (WT) and the ygl9 mutant

为了探究叶色变异对突变体光合作用的影响, 在孕穗期对野生型和突变体的净光合速率、气孔导度、胞间CO₂浓度、蒸腾速率4个光合特性指数进行测量。ygl9净光合速率与野生型相比并没有明显差异(图3-A), 而气孔导度比野生型提高了101.97% (图3-B), 差异达到了极显著水平。可能因为气孔导度的增加, 突变体细胞更容易摄取空气中的CO₂, 蒸腾作用也更加强烈, 所以突变体的胞间CO₂浓度和蒸腾速率也极显著提高, 分别比野生型增加了11.53%和73.21% (图3-C, D)。

透射电镜观察表明, 野生型和ygl9突变体叶肉细胞发育完全, 叶绿体规则地贴壁分布, 完整地被膜包裹, 大小相似, 叶绿体内部均有基粒、基质和片层结构。但野生型叶绿体基粒丰富, 基质浓厚, 基质片层排列整齐紧密(图5-A~C); 而ygl9突变体叶绿体嗜锇小体增多, 基粒模糊, 基质片层明显少于野生型且较为疏松(图5-D~F)。

图3

Fig. 3

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	图3 野生型(WT)和ygl9突变体的光合速率、气孔导度、胞间CO2浓度以及蒸腾速率对比Fig. 3 Comparison of photosynthetic rate, stomatal conductance, intercellular CO2 concentration and transpiration rate between the wild type (WT) and theygl9mutant

以表型正常的不育系西农1A与突变体ygl9杂交, 所有F₁植株均表型正常。F₂群体出现明显的双亲性状分离现象, 在3156株群体中正常单株2397株、黄绿叶突变单株759株, 经卡平方测验, 符合3∶ 1分离比(χ ²=1.14 < χ ²_0.05=3.84), 表明ygl9黄绿叶突变性状受1对隐性基因控制。

图4

Fig. 4

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	图4 野生型(WT)和ygl9突变体的气孔扫描电镜观察Fig. 4 Scanning electron microscopy observation of stomatal characteristics in the wild type (WT) and the ygl9 mutant

图5

Fig. 5

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	图5 抽穗期野生型(WT)和ygl9突变体的细胞超微结构Fig. 5 Cell ultrastructure of the wild type (WT) and the ygl9 mutant during the heading stage

以西农1A与ygl9杂交的F₂代群体作为定位群体, 用均匀分布于水稻12条染色体上的400对SSR引物和60对InDel引物扩增亲本和基因池DNA。结果显示, 位于第3染色体短臂上的RM14281、Ind03-2、Ind03-7和Ind03-8可能与YGL9连锁。为验证连锁关系, 利用这4对引物进一步分析了210株F₂突变单株, 发现RM14281、Ind03-2、Ind03-7和Ind03-8的重组子个数分别为36、3、20和40个, 其中RM14281的重组子包含Ind03-2的重组子, Ind03-8的重组子包含Ind03-7的重组子, 且Ind03-2和Ind03-7的重组子不同, 因此初步将YGL9基因定位于Ind03-2和Ind03-7之间。

在初步定位区间内设计了12对InDel引物和44对SSR引物, 其中S03-1、S03-42、Ind03-13和Ind03-19在亲本间表现多态性, 利用多态性引物进一步分析759株F₂定位群体。发现, SSR标记S03-1有2个重组子, InDel标记Ind03-19有1个重组子, 且二者的重组子不同。因此, 最终将YGL9精细定位在标记S03-1和Ind03-19之间, 遗传距离分别为0.13 cM和0.07 cM, 物理距离为63 kb (图5)。根据Gramene网站上提供的基因注释信息, 该区间内共有11个开放阅读框(open reading frame, ORF), 分别编码过氧化氢酶、泛素类蛋白、核苷酸转移酶、电子载体/蛋白质二硫键氧化还原酶、卷曲螺旋域结合蛋白124、还原转座子、叶绿体信号识别颗粒、AMP结合域蛋白、假定蛋白、棒曲霉素蛋白和HV22蛋白。