基于西南地区玉米地方品种的地域分布和种质特征, 结合田间鉴定地方品种农艺、经济性状及SSR标记的遗传多样性分析, 从四川、重庆、云南和贵州选取典型特色、代表性好的地方品种40份, 由长江师范学院玉米育种课题组提供, 材料编号及地理来源见表1。

在培养箱中发芽, 取黄化幼苗叶片约3 g在液氮中研磨, 采用CTAB法^[16]]抽提并纯化基因组DNA, 利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度和质量。

PCR扩增片段为Glb 1基因启动子(200 bp)及其后的约1000 bp序列, 扩增的引物序列为F: 5′ -CCG GAT AAG CAC GGT AAG GA-3′ ; M: 5′ -CTT GCT GAA GCT CGA CAG GA-3′ 。引物由上海生工生物工程有限公司合成, 扩增产物约1200 bp。PCR体系50 µ L含2× Taq Master Mix 25 µ L, 上、下游引物(10 nmol mL^-1)各0.5 µ L, DNA 2 µ L (含50 ng DNA), 无RNase水 22 µ L。在Eppendorf AG PCR仪上进行反应, 反应程序为94℃预变性5 min, 1个循环; 94℃变性1 min, 53℃退火1 min, 72℃延伸2 min, 共35个循环; 最后于72℃延伸10 min。用上海生工生物工程有限公司SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒回收PCR扩增产物, 将扩增产物连接到质粒载体PMD19-T (TaKaRa)后, 再转染感受态大肠杆菌菌株DH5a。在含有氨苄青霉素培养基上培养感受态菌株, 挑取阳性克隆, DNA测序由上海生工生物工程有限公司完成。

将测序得到的各DNA序列提交GenBank核酸序列数据库, 获取GenBank登录号(表1), 并在GenBank中下载部分近缘物种的同源序列: 普通玉米(AF064212、DQ356513、DQ356524、EF635959、EU643507)、小颖玉米(AF064233、EF539575、EF536901、EF539611、EF539645)、繁茂玉米(AF064228~ AF064232)和磨擦禾(AF064233~AF064235、AF377694)。根据植物学分类和地理来源将序列划分为四川玉米地方品种、重庆玉米地方品种、云南玉米地方品种、贵州玉米地方品种、栽培玉米、小颖玉米、繁茂玉米和磨擦禾共8个种群。通过对Glb 1基因序列的多态性分析及其统计学检验研究西南地区玉米地方品种的种群演化。

采用DNAMAN 6软件进行序列比对分析, 用DAMBE软件进行序列格式转换, 用MEAGA 6软件计算突变位点数、多态位点数、简约信息位点数和单显突变数, 用DnaSP^[17]软件计算Glb 1基因同义替代位点数、非同义替代位点数、碱基替代位点数、遗传多态性指数 和 以及共有多态数和固定差异数, 采用Tajima^[18]、Fu和Li^[19]的方法检验种群内基因平衡进化。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 西南地区玉米地方品种群体来源及Glb 1基因序列登录号 Table 1 Geographical origin and Glb 1 sequence accession number of maize landraces from the southwest of China 品种群体 Population 编号 Code 玉米地方品种 Maize landrace 地理来源 Geographical origin GenBank登录号 Accession No. 四川地方品种 Maize landrace from Sichuan S01 汉源红 Hanyuanhong 四川汉源 Hanyuan, Sichuan, China KP203907 S02 丹巴黄玉米 Danbahuangyumi 四川丹巴 Danba, Sichuan, China KP203909 S03 青神黄玉米 Qingshenhuangyumi 四川青神 Qingshen, Sichuan, China KP203911 S04 叙永糯玉米 Xuyongnuoyumi 四川叙永 Xuyongnuo, Sichuan, China KP203916 S05 筠连玉米 Junlianyumi 四川筠连 Junlian, sichuan, China KP203919 S06 筠连糯玉米 Junliannuoyumi 四川筠连 Junlian, Sichuan, China KP203931 S07 雷波白包谷 Leibobaibaogu 四川雷波 Leibo, Sichuan, China KP203932 S08 小金包谷 Xiaojinbaogu 四川小金 Xiaojin, Sichuan, China KP203933 S09 冕宁玉米 Mianningyumi 四川冕宁 Mianning, Sichuan, China KP203936 S10 康定甜玉米 Kangdingtianyumi 四川康定 Kangding, Sichuan, China KP203937 重庆地方品种 Maize landrace from Chongqing C01 奉节包谷 Fengjiebaogu 重庆奉节 Fengjie, Chongqing, China KP203896 C02 强龙玉米 Qianglongyumi 重庆武隆 Wulong, Chongqing, China KP203900 C03 五彩玉米 Wucaiyumi 重庆石柱 Shizhu, Chongqing, China KP203901 C04 粉质玉米 Fenzhiyumi 重庆丰都 Fengdu, Chongqing, China KP203948 C05 彭水糯玉米 Pengshuinuoyumi 重庆彭水 Pengshui, Guizhou, China KP203905 C06 暨龙玉米 Jilongyumi 重庆丰都 Fengdu, Chongqing, China KP203914 C07 金黄早 Jinhuangzao 重庆涪陵 Fuling, Chongqing, China KP203915 C08 兴隆玉米 Xinglongyumi 重庆酉阳 Youyang, Chongqing, China KP203918 C09 黔江白玉米 Qianjiangbaiyumi 重庆黔江 Qianjiang, Chongqing, China KP203938 C10 长寿红玉米 Changshouhongyumi 重庆长寿 Changshou, Chongqing China KP203939 云南地方品种 Maize landrace from Yunnan Y01 武定粉玉米 Wudingfenyumi 云南武定 Wuding, Yunnan, China KP203897 Y02 江川糯玉米 Jiangchuannuoyumi 云南江川 Jiangchuan, Yunnan, China KP203917 Y03 黄团粒 Huangtuanli 云南屏边 Pingbian, Yunnan, China KP203922 Y04 马牙玉米 Mayayumi 云南盈江 Yingjiang, Yunnan, China KP203923 Y05 黄糯玉米 Huangnuoyumi 云南绿春 Lü chun, Yunnan, China KP203924 Y06 玉米白粒种 Yumibailizhong 云南会泽 Huize, Yunnan, China KP203925 Y07 梁河白马牙 Lianghebaimaya 云南梁河 Lianghe, Yunnan, China KP203927 Y08 白马牙 Baimaya 云南陇川 Longchuan, Yunnan, China KP203928 Y09 龙江白 Longjiangbai 云南腾冲 Tengchong, Yunnan, China KP203929 Y10 元江甜玉米 Yuanjiangtianyumi 云南昆明 Kunming, Yunnan, China KP203942 贵州地方品种 Maize landrace from Guizhou G01 遵义红包谷 Zunyihongbaogu 贵州遵义 Zunyi, Guizhou, China KP203947 G02 仁怀糯包谷 Renhuainuobaogu 贵州仁怀 Renhuai, Guizhou, China KP203899 G03 紫云糯包谷 Ziyunnuobaogu 贵州紫云 Ziyun, Guizhou, China KP203902 G04 望谟粘包谷 Wangmozhanbaogu 贵州望谟 Wangmo, Guizhou, China KP203903 G05 大黄粒 Dahuangli 贵州毕节 Bijie, Guizhou, China KP203949 G06 安顺包谷 Anshunbaogu 贵州安顺 Anshun, Guizhou, China KP203904 G07 金沙包谷 Jinshabaogu 贵州金沙 Jinsha, Guizhou, China KP203906 G08 石阡糯玉米 Shiqiannuoyumi 贵州石阡 Shiqian, Guizhou, China KP203920 G09 松桃糯玉米 Songtaonuoyumi 贵州松桃 Songtao, Guizhou, China KP203935 G10 铜仁甜玉米Tongrentianyumi 贵州铜仁 Tongren, Guizhou, China KP203945

表1 西南地区玉米地方品种群体来源及Glb 1基因序列登录号 Table 1 Geographical origin and Glb 1 sequence accession number of maize landraces from the southwest of China

采用最大似然法(Maximum Likelihood, ML)分析系统发育, 采用MEAGA 6软件分析ML, 贝叶斯推断采用MrBayes 3.2.3软件进行模型和参数估计^[20], 利用Jmodeltest 2进行模型检验, 基于hLRT标准选择的最适碱基替代模型, 外显子 + 内含子序列数据最适碱基替代模型是GTR+G, 外显子序列数据最适碱基替代模型是T92+G, 内含子序列数据最适碱基替代模型是JC+G。ML分析采用最大似然法进行系统树构建(Test Maximum Likehood Tree), 并采用自展分析(Bootstraps, BS)进行检验, 自展分析重复250次。

采用系统网状重建法(The phylogenetic network reconstruction method)分析种群单体型的系谱关系。首先利用HyPhy软件中的GARD方法分别检测Glb 1基因外显子、内含子及外显子 + 内含子的重组信息, 结果表明Glb 1基因外显子为非重组DNA序列(lg Likelihood = -2715.35, AIC=5016.54), 因此, 利用外显子序列数据资料构建网络支系图^{[21, 22]}。采用Network 5.4.4.0软件(Fluxus Technology Ltd., Clare, Suffoik, UK)中的中介连接网络法(the median-joining network method)进行网状支系分析。

根据序列比对结果, 供试DNA序列平均长度为1132 bp, 变幅953~1157 bp。在DNA序列中检测到810个突变位点, 其中多态性位点625个, 简约信息位点232个, 单显突变(singleton) 114个。各取样序列外显子、内含子长度变异和多态性位点见表2。在8个种群中, 小颖玉米的突变位点数最多, 其外显子中有24个核苷酸同义替换、15个非同义替换; 四川地方品种、重庆地方品种、云南地方品种和贵州地方品种的突变位点数分别为35、25、33和25个, 以四川地方品种最高; 供试8个种群外显子平均长度为757 bp, 变幅751~762 bp, 表明Glb 1基因编码区长度较为保守。

比较各种群的遗传多态性指数 (表3), 小颖玉米的遗传多态性最高(0.0355), 繁茂玉米的最低(0.0106)。在西南地区4个玉米地方品种类群中, 四川地方品种最高(0.0318), 序列多态性占小颖玉米的87%, 重庆地方品种、云南地方品种和贵州地方品种的遗传多态性指数分别为0.0306、0.0303和0.0253, 均高于普通玉米(0.0155)、繁茂玉米(0.0106)和磨擦禾(0.0129)。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 种群内Glb 1基因多态位点 Table 2 Polymorphic sites of Glb 1 genes in the eight taxa 种群 Taxon 样本数 Sample number 外显子Exon 内含子Intron 同义替代 Syn 非同义替代 Rep 平均长度 AL 替换位点Subs 平均长度 AL 四川地方品种 Landrace from Sichuan 10 7 28 761 12 198 重庆地方品种 Landrace from Chongqing 10 7 18 757 12 200 云南地方品种 Landrace from Yunnan 10 11 21 756 12 199 贵州地方品种 Landrace from Guizhou 10 5 20 755 9 207 普通玉米 Common maize 5 13 21 751 11 206 小颖玉米 Parviglumis 5 24 15 757 21 201 繁茂玉米 Z. luxurians 5 5 10 759 7 197 摩擦禾T. dactyloides 4 4 11 762 1 192 Syn: the number of synonymous polymorphisms in exon; Rep: the number of replacement or nonsynonymous polymorphisms in exons; Subs: the number of base substitutions in intron; AL: the average sequence length of the taxa.

表2 种群内Glb 1基因多态位点 Table 2 Polymorphic sites of Glb 1 genes in the eight taxa

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 种群内Glb 1基因序列多态性和中性进化检验 Table 3 Sequence polymorphism and neutral evolution test of Glb 1 genes in the eight taxa 种群Taxon N S H (bp) (bp) D FD Ffl Rm 四川玉米地方品种 Landrace from Sichuan 10 62 10 0.0269 0.0310 -0.245 -0.244 -0.265 10 重庆玉米地方品种 Landrace from Chongqing 10 82 10 0.0226 0.0306 -1.288 -1.386 -1.539 6 云南玉米地方品种 Landrace from Yunnan 10 83 10 0.0223 0.0303 -1.314 -1.359 -1.523 6 贵州玉米地方品种 Landrace from Guizhou 10 57 10 0.0170 0.0253 -1.604 -1.541 -1.759 2 普通玉米 Common maize 5 35 5 0.0155 0.0155 0.000 0.000 0.000 6 小颖玉米 Parviglumis 5 96 5 0.0323 0.0355 -0.461 -0.555 -0.600 3 繁茂玉米 Z. luxurians 5 24 5 0.0111 0.0106 0.310 0.309 0.333 1 摩擦禾 T. dactyloides 4 24 4 0.0120 0.0129 -0.727 -0.727 -0.758 0 N: 样本数; S: 分离位点数; H: 单体型数; D: Tajima’ D; FD: Fu and Li’ D; Ffl: Fu and Li’ F; Rm: 最小重组值。 N: sample numbers; S: the number of segregating sites; H: haploid number; D: Tajima’ D; FD: Fu and Li’ D; Ffl: Fu and Li’ F; Rm: the minimum recombination number.

表3 种群内Glb 1基因序列多态性和中性进化检验 Table 3 Sequence polymorphism and neutral evolution test of Glb 1 genes in the eight taxa

由种群内基因平衡进化检验结果(表3)可知, 各种群Tajima’ D、Fu and Li’ D和Fu and Li’ F均不显著, 且为负值, 表明Glb 1基因在各种群中是中性进化基因位点, 不存在选择作用。

共有多态性(shared polymorphisms)是未被遗传漂变消除的多态性, 与群间分歧年代负相关, 而与奠基群体大小正相关, 固定差异(fixed differences)代表种群在独立演化过程中不同的遗传漂变^{[23, 24]}。通过比较种群间DNA序列的共有多态性和固定差异, 可分析其遗传相关性。由表4可知, 4个玉米地方品种群体DNA序列间具有较高的共有多态性, 而不存在固定差异, 其中四川地方品种与重庆地方品种、云南地方品种和贵州地方品种间的共有多态数分别达56、54和49, 固定差异数均为0。相反, 4个玉米地方品种群体与小颖玉米、繁茂玉米、磨擦禾3个近缘种群间存在较高的固定差异和较低的共有多态性, 与磨擦禾间的共有多态数均为0。就小颖玉米而言, 其DNA序列与4个玉米地方品种群体DNA序列间有较高的共有多态性, 共有多态数变幅为20~28; 与普通玉米有1个固定差异, 21个共有多态数。这在Glb 1序列上反映了西南地区玉米地方品种与近缘种群间的遗传关系, 玉米地方品种与普通玉米和小颖玉米有相近的遗传关系, 与繁茂玉米和磨擦禾有较远的遗传关系。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 种群间的共有多态数和固定差异数 Table 4 Number of shared polymorphisms and fixed differences between taxa PI PII PIII PIV PV PVI PVII PII 56 (0) PIII 54 (0) 48 (0) PIV 49 (0) 50 (0) 46 (0) PV 28 (0) 28 (0) 28 (0) 28 (0) PVI 20 (0) 20 (0) 23 (0) 28 (0) 21 (1) PVII 2 (8) 3 (8) 2 (8) 19 (0) 2 (13) 21 (1) PVIII 0 (94) 0 (95) 0 (96) 0 (92) 0 (98) 0 (86) 0 (95) The numbers above and below (in parenthesis) stand for the number of shared polymorphisms and fixed differences, respectively. PI: landrace from Sichuan; PII: landrace from Chongqing; PIII: landrace from Yunnan; PIV: landrace from Guizhou; PV: common maize; PVI: parviglumis; PVII: Z. luxurians; PVIII: T. dactyloides. 表内上面和下面(括号内)的数值分别表示共有多态数和固定差异数。PI: 四川地方品种; PII: 重庆地方品种; PIII: 云南地方品种; PIV: 贵州地方品种; PV: 普通玉米; PVI: 小颖玉米; PVII:繁茂玉米; PVIII: 摩擦禾。

表4 种群间的共有多态数和固定差异数 Table 4 Number of shared polymorphisms and fixed differences between taxa

基于8个种群Glb 1基因序列的“ 外显子+内含子” 区, 采用最大似然法(ML)构建系统发育树(图1)的似然值为-3310.072, 4种核苷酸的理论频率为A: 0.1804、G: 0.3507、T: 0.1571、C: 0.3118, 不变位点的比率为0.4838, γ 形值(gamma shape parameter)为0.6888。系统发育关系树显示出玉蜀黍和磨擦禾两大分支, 玉蜀黍分支分为A、B两个亚支。A亚支包括支系A₁、A₂、A₃、A₄和A₅, 支系A₁由7个云南地方品种、7个重庆地方品种、1个四川地方品种和5个普通玉米品种构成(BP = 72), 支系A₂由分别来自重庆、四川和云南的1个地方品种构成(BP = 73), 支系A₃包括1个小颖玉米、8个四川地方品种、1个重庆地方品种和1个云南地方品种(BP = 100), 来自贵州的10个地方品种、1个重庆地方品种和1个云南地方品种构成支系A₄ (BP = 58), 1个小颖玉米单独构成支系A₅ (BP = 89); B亚支包括支系B₁和系B₂, 支系B₁仅由1个小颖玉米构成(BP = 97), 支系B₂包括3个小颖玉米和5个繁茂玉米(BP = 100)。由系统发育树(图1)可见, 相同地理来源的玉米地方品种有相近的遗传关系, 多数同一地理来源的地方品种聚居在同一支系。

图1

Fig. 1

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	图1 8个种群Glb 1基因系统发育树Fig. 1 Phylogenetic tree ofGlb 1 genes in the eight taxa

为进一步明确种群间系统演化关系, 利用近缘种小颖玉米、普通玉米和玉米地方品种Glb 1基因外显子区的序列变异进行网状进化关系分析, 网状支系图(图2)显示了来自小颖玉米、普通玉米和4个地方品种供试种群50个单体型的系谱关系。由图2可见, 供试种群的50个单体型被划分成四大支系。支系I由10个贵州地方品种单体型、1个重庆地方品种单体型和1个普通玉米单体型构成, 支系II由9个重庆地方品种单体型、4个四川地方品种单体型、2个云南地方品种单体型和3个普通玉米单体型构成, 6个四川地方品种和1个普通玉米单体型构成支系III, 8个云南地方品种单体型构成支系IV。其中, 5个小颖玉米均单独成支且位于中间位置, 3个普通玉米位于支点中央三, 玉米地方品种成群分居, 这与Glb 1基因序列的系统进化关系分析一致。

图2

Fig. 2

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	图2 玉米地方品种、普通玉米和小颖玉米Glb 1基因外显子单体型的网状进化关系Fig. 2 Network relationships of exon haplotypes ofGlb 1 genes in maize landraces, common maize, and parviglumis

基因序列多态性是生物种群演化的基础, 而序列多态性和基因进化是物种在同一演化过程中的两个不同层次^[25]。分析单拷贝核基因序列的遗传多态性可了解基因在不同种群中的演化进程。Buckler等^[26]通过分析现代玉米与其祖先种在多个基因位点上的序列变异, 发现现代玉米在驯化过程中保留了祖先种70%的遗传多样性。Chen和Li^[27]的研究表明, 任两个玉米品种在DNA沉默位点的差异达1.4%, 是其他禾本科作物的14倍, 相当于灵长类黑猩猩与人的差异。本研究在Glb 1基因序列中检测到810个突变位点、625个多态性位点、232个简约信息位点, 遗传多态性指数 的大小排序为小颖玉米、四川地方品种、重庆地方品种、贵州地方品种、普通玉米、磨擦禾和繁茂玉米, 玉米地方品种群体Glb 1基因序列多态性较高, 四川、重庆、云南和贵州地方品种的序列多态性分别是小颖玉米的87%、86%、85%和71%, 分别是普通玉米的2.00、1.97、1.95和1.63倍。此外, Glb 1基因序列的网状支系分析发现, 40个玉米地方品种序列有40个单体型, 由此表明地方品种群体在该位点有较高的遗传多态性。

玉米起源于美洲, 在墨西哥进化后, 向北美和南美传播。玉米作为重要的粮食和饲料作物, 在美洲驯化历史达5000年之久, 并在全球范围内进行了长达3000多年的广泛栽培。目前还未发现具有现代栽培玉米植株形态的的野生玉米, 玉米首次传入我国准确的年代和途径尚无定论。据古籍记载, 1511年前玉米引入我国, 可能有两条引入途径, 一条是由印度经西藏传入四川, 另一条是由海路传入东南沿海地区, 再扩散到内地^[1]。玉米传入我国后, 经近500年的风土驯化, 形成了极为丰富的地方品种类型, 并在其进化过程中产生了由新的隐性基因控制的多样化区域, 即次生基因中心^[28]。

由Glb 1基因序列的系统进化关系发现, 地方品种和普通玉米在同一亚支, 表明地方品种与现代玉米相近的起源与演化, 同时支持Iltis和Doebley^[29]对于玉蜀黍属的分类系统。基于SSR标记和B染色体多态性分析, 笔者^{[10, 30]}发现四川玉米地方品种有较高的遗传多样性, 为玉米由印度经西藏传入四川提供了证据。本研究结果表明, 西南地区玉米地方品种有较高的遗传多态性, 其中四川玉米地方品种有最高的遗传多态性指数, 高于其余3个西南地区地方品种群体。就单体型的系谱关系而论, 四川玉米地方品种10个单体型分居两大支系, 且与普通玉米单体型相邻, 反映了单体型间较大的遗传差异。这为我国玉米由印度经西藏传入四川提供了佐证, 同时表明西南地区玉米地方品种最早在四川种植, 逐步向毗邻地区扩散。